生命早期营养不良诱导肺血管内皮细胞功能失调的表观调控机制研究

摘要

生命早期（一般指胎儿期、婴幼儿期）是生长发育的关键时期，这一阶段正是机体各器官、组织、细胞分化形成和发育成熟时期;该阶段可塑性强，多数器官和系统的发育在这个“时间窗”对环境敏感且易变，不良应激可导致疾病的发生和发展的易感性增强。
　　据世界卫生组织统计，全球每年出生1200多万早产儿，占新生儿总数的9.6％。按照我国目前的出生率和早产发生率计算，每年出生约150万早产儿，占全球早产儿总数的十分之一以上。宫外生长迟缓(Extrauterine growth restriction，EUGR)指小儿出生后生长发育计量指标在相应宫内生长速率期望值的第10百分位水平以下（≤生长曲线的第10百分位）。EUGR在早产儿中发生率极高，问题十分突出。
　　大量的人群流行病学资料调查、前瞻性临床研究和动物实验研究结果表明，生命早期所处环境的不良刺激不仅影响出生前和出生后的生长发育，而且会对成年后的健康和生活质量产生远期乃至终生影响，此即成人疾病的胎儿起源假说(fetal origins of adult disease，FOAD)和“发育起源的健康与疾病”(developmentorigin of Health and disease,DOHaD)学说。
　　越来越多的证据揭示了表观调控机制在发育起源的健康与疾病中起到重要作用。表观遗传学是研究不涉及DNA序列改变的基因表达和调控的可遗传修饰，包括DNA甲基化、组蛋白修饰、RNA干扰等。检测DNA甲基化与组蛋白修饰的表观遗传学方法主要由染色质免疫沉淀技术，以及在经过全基因组甲基化芯片芯片初步筛选后，Sequenom特定DNA段甲基化检测技术对差异甲基化基因位点进行技术验证。目前由于生命早期不良的营养环境相关的成人期肺部疾病发生的表观遗传调控机制已经有了初步的认识，然而，由生命早期营养受限所诱导的肺动脉高压中是否存在表观遗传调控尚不清楚。
　　鉴于现有的资料，我们假设
　　1.生命早期营养受限可诱导肺血管功能相关的基因eNOS的表观遗传修饰的改变（DNA甲基化与组蛋白修饰），并且可能存在性别的差异。
　　2.生命早期营养受限所致的成年期肺动脉高压，存在着一系列相关基因的表观遗传修饰的改变。而且这些相关基因的早期表观修饰改变可以引起个体成年期对外界刺激因素高度敏感，导致肺血管内皮细胞功能调控紊乱，从而发生肺动脉高压。
　　这些表观遗传修饰改变可以引起个体对环境等刺激因素高度敏感，导致肺动脉高压的发生。如果在个体发育早期阶段给予适当的干措施，阻止或逆转相关基因的表观修饰，可能对降低成年后发生肺动脉高压有保护作用。
　　第一部分宫外生长迟缓改变肺血管内皮细胞eNOS的表达的表观调控机制
　　目的:
　　大量的人群流行病学资料调查、前瞻性临床研究和动物实验研究结果表明，生命早期所处环境的不良刺激不仅影响出生前和出生后的生长发育，而且会对成年后的健康和生活质量产生远期乃至终生影响。此即“发育起源的健康与疾病”(development origin of Health and disease，DOHaD)学说。目前生命早期不良的营养环境相关的成人期疾病发生的表观遗传调控机制已经有了初步的认识，然而，由生命早期营养受限对肺血管内皮细胞的作用尚不清楚。肺血管内皮细胞由内皮型一氧化氮合成酶(eNOS)产生的一氧化氮(NO)在肺动脉高压的发病中有重要作用，而内皮细胞eNOS的表达是受到表观遗传调控的。本研究的目的是探索在生命早期营养不良(EUGR)模型中肺血管内皮细胞中eNOS基因的表观遗传修饰的改变。
　　方法:
　　SD大鼠EUGR模型建立，对哺乳期新生仔鼠进行饮食限制，制备EUGR模型。正常对照组饲养模式:10只仔鼠/窝;EUGR组喂养模式:20只仔鼠/窝。生后21天离乳的雌雄SD大鼠，磁珠激活的细胞分选技术(MACS)分离获得肺血管内皮细胞(Pulmonary Vascular Endothelial Cell，PVEC)。Real-time PCR和Western blot用于检测eNOS基因的mRNA和蛋白的表达水平;染色质免疫沉淀技术和Sequenom特定DNA段甲基化检测技术用于分析eNOS基因的组蛋白修饰和DNA甲基化的表观调控机制的变化。
　　结果:
　　EUGR模型评估:EUGR组SD大鼠哺乳期生长速率明显低于对照组，生后21天离乳时，体重与对照组相比明显下降，降低30％左右。3周的EUGR组雌雄SD大鼠肺血管内皮细胞(PVEC)中，eNOS基因mRNA和蛋白水平明显低于对照组;eNOS基因近端启动子区域的组蛋白H3K9met3和H3K27met3水平均高于正常对照组，雄性SD大鼠H3K27met3增加更明显，有统计学差异;雌性EUGR组的eNOS基因启动子DNA甲基化比对照组要高，有统计学差异;然而，雄性SD大鼠的eNOS基因启动子DNA甲基化程度，两组之间无显著的统计学差异。
　　结论:
　　生命早期饮食受限的EUGR模型对SD大鼠肺血管内皮细胞中的eNOS基因的表达有影响。eNOS mRNA和蛋白表达减少与该基因启动子区域的组蛋白“抑制性标记物”H3K27met3水平增加密切相关;雌性EUGR组eNOS基因启动子区域的DNA高甲基化可能与eNOS mRNA表达减少有关。eNOS基因的表观修饰改变与减少的eNOS基因mRNA和蛋白水平相一致。表观遗传调控可能是EUGR模型中肺血管内皮细胞eNOS基因表达改变的机制之一，表观遗传调控的改变存在性别的差异。
　　第二部分宫外生长迟缓诱导成年期肺动脉高压肺血管内皮细胞的表观调控机制
　　目的:
　　生后早期是生长发育的关键时期，可塑性强，多数器官和系统的发育在这个“时间窗”对环境敏感且易变，不良应激可导致疾病的发生和发展的易感性增强。生命早期营养不良不仅可以增加成年期代谢性疾病和心血管系统疾病的发病风险，还可以导致肺血管张力改变、肺血管重构，但引起肺血管功能失调的机制尚不十分清楚。EUGR在早产儿中发生率极高，问题十分突出。目前，生命早期营养受限相关的成人期疾病发生的表观遗传调控机制有了初步的认识，有研究推测相关基因的DNA甲基化与组蛋白修饰异常可能参与生命早期营养干预导致的肺血管功能失调。而且这些相关基因的早期表观修饰改变可以引起个体成年期对等外界刺激因素高度敏感，导致肺血管张力调控紊乱，从而发生肺动脉高压。本实验的目的是为了探索EUGR导致的肺血管功能失调与DNA甲基化与组蛋白修饰异常改变的关系。
　　方法:
　　SD大鼠EUGR模型的建立。经右侧颈外静脉进行肺动脉插管，测量生后9周EUGR雄性大鼠肺动脉平均压力。分离心脏组织，计算右心指数。对大鼠的肺组织进行免疫组化染色，评价肺血管重构情况。生后9周的雄SD性大鼠，磁珠激活的细胞分选技术(MACS)分离获得肺血管内皮细胞。Western blot用于评估eNOS蛋白的表达，Real-time RT-PCR技术用于验证DNA甲基化异常调节基因的mRNA表达水平。染色质免疫沉淀技术用于分析eNOS、IGF-1、PPARγ基因的组蛋白修饰改变。对分选的PVECs进行全基因组DNA甲基化芯片(MeDIP)分析。Sequenom特定DNA段甲基化检测技术对差异甲基化基因位点进行技术验证。
　　结果:
　　EUGR组雄性大鼠哺乳期到生后9周生长速率均低于对照组。9周SD雄性大鼠肺血管功能失调:肺动脉平均压增高，右心指数数值增加，免疫组化结果肺小动脉发生重构。DNA甲基化芯片分析:筛选出来EUGR组与Control组之间DNA甲基化差异表达基因的近500多个。Gene Ontology分析:这些发生高甲基化水平改变的基因多与血管发育相关。这些发生低甲基化水平改变的基因与分化相关和参与信号转导为主。DNA甲基化芯片结果显示Fgfr2、RhoC、Notch1呈高甲基化状态，Fgfr2、RhoC、Notch1三个基因的mRNA表达水平表达降低。eNOS、PPARγ、IGF-1基因的mRNA表达与DNA甲基化状态和组蛋白修饰的改变有关。
　　结论
　　宫外生长迟缓(EUGR)模型雄性大鼠在成年期可出现肺血管功能失调，主要表现为肺动脉平均压力增高，右心指数增加，肺血管重构。EUGR可导致成年期大鼠肺血管内皮细胞相关基因发生DNA甲基化异常改变。eNOS、PPARγ、IGF-1、Notch1、Fgfr2、RhoC等基因表观遗传修饰的改变可能是EUGR导致肺血管功能失调的发生机制之一。