富集文库法开发甜叶菊微卫星分子标记

摘要

甜叶菊是一种低热值、高甜度的新兴经济作物，其应用价值得到人们的广泛关注。现今分子标记已应用在各种作物的遗传分析领域，而甜叶菊的分子生物学研究刚刚起步。
　　本文探讨了甜叶菊微卫星富集文库的构建，成功开发了甜叶菊微卫星标记，并对所开发出微卫星标记的通用性进行检测。具体研究结果如下:
　　1.微卫星文库构建:利用表现性状优良的甜叶菊品种构建甜叶菊微卫星富集文库。利用限制性内切酶Sau3AⅠ酶切基因组，以生物素标记的(AT)15、(AC)15、(AG)15、(GAT)12微卫星探针，通过磁珠富集法构建了4个微卫星富集文库。除微卫星探针(AT)15由于杂交温度较低，无法成功构建富集文库外，其它3个微卫星探针都成功建成微卫星富集文库。从3个富集文库中共得到809个克隆，运用两次引物筛选法筛选克隆后，对筛选得到的392个克隆进行测序，共获得含有微卫星序列的克隆269个。对含有微卫星的序列进行类型统计，并设计微卫星引物，最终设计得到177对微卫星引物。
　　2.引物多态性检测:运用甜叶菊品系177-11对开发得到的177对微卫星引物进行引物稳定性的检测，其中有152条引物可得到稳定的扩增条带。通过24个甜叶菊品系对能扩增出条带的引物进行多态性检测，筛选得到56对具有多态性的引物，总共检测到190个等位基因变异，每个位点的等位基因数在2～8个不等，平均每个位点的等位基因为3.39个。分析发现，多态性信息含量(PIC)值在0.0763～0.7595之间，平均为0.4542;观测杂合度(Ho)在0.2154～0.9167之间，期望杂合度(He)在0.1197～0.8076之间，总体上筛选得到的多态性标记有良好的多态性。
　　3.品系遗传多样性分析:通过聚类图发现，以遗传相似系数0.68为阈值，可将24份甜叶菊品种分为两大类，基本上是按照叶型进行区分的。同时，按照材料中总糖甙含量（total glycoside，TG）以及瑞鲍迪甙A（rebaudiosideA，RA）和甜菊甙(stevioside，ST)的不同，可将全部供试材料分成TG类与RA和ST两大类型。
　　4.微卫星标记扩增物种通用性检测:用与甜叶菊同科的6种蔬菜，对甜叶菊中开发得到56对具有多态性的引物进行PCR扩增，检测发现仅有15条引物能够扩增出条带，但扩增出的条带都无多态性表现，且条带大多较为模糊。由此可见，尽管可以从近缘物种中获得通用性引物，但由于很多近缘物种微卫星无法稳定扩增，在通用性方面相对有限，而本研究从甜叶菊开发出的微卫星标记，虽然6种蔬菜与甜叶菊同属一个科，但亲缘关系较远，加之基因组相差太大，故在引物通用性方面不能通用。

目录

论文说明

声明

致谢

摘要

1 引言

2 文献综述

2．1 甜叶菊概述

2．1．1 甜叶菊的起源与分布

2．1．2 甜叶菊的安全性

2．1．3 甜菊糖的主要化学成分

2．1．4 甜叶菊的应用

2．1．5 甜叶菊的生产现状

2．2 分子标记概述

2．2．1 遗传标记的概述

2．2．2 分子标记的种类及其原理特点

2．2．3 分子标记间的比较

2．2．4 分子标记的应用

2．3 分子标记在甜叶菊中的研究现状

2．4 微卫星标记开发策略

2．4．1 传统方法开发微卫星标记

2．4．2 引物富集法开发微卫星标记

2．4．3 杂交筛选法开发微卫星标记

2．4．3 生物信患学方法开发微卫星标记

2．4．4 从近缘物种中获得微卫星标记

2．5 微卫星富集文库构建的注意事项

2．5．1 生物素标记的微卫星探针及磁珠

2．5．2 杂交与洗脱条件的控制

2．6 遗传多态性

2．7 研究目的及意义

3 材料与方法

3．1 甜叶菊微卫星富集文库构建

3．1．1 试验材料

3．1．2 试验方法

3．2 微卫星引物多态性筛选及甜叶菊遗传多样性分析

3．2．1 试验材料

3．2．2 试验方法

3．3 微卫星标记在跨物种间通用性检测

3．3．1 试验材料

3．3．2 试验方法

4 结果与分析

4．1 甜叶菊微卫星富集文库构建结果分析

4．1．1 基因组DNA质量检测

4．1．2 基因组DNA酶切结果

4．1．3 预扩增PCR产物结果

4．1．4 不同富集文库富集结果

4．1．5 不同微卫星文库的阳性克隆筛选结果

4．1．6 序列分析及数据统计

4．1．7 微卫星引物设计

4．2 微卫星引物多态性筛选及甜叶菊遗传多样性结果分析

4．2．1 基因组DNA质量检测结果

4．2．2 微卫星引物稳定性检测

4．2．3 微卫星引物多态性鉴定及分析

4．2．4 甜叶菊品种遗传多样性聚类分析

4．3 微卫星标记在跨物种间通用性检测结果

4．3．1 基因组DNA质量检测结果

4．3．2 微卫星引物稳定性检测

5 讨论

5．1 甜叶菊微卫星富集文库构建分析

5．1．1 微卫星富集文库注意要点

5．1．2 不同物种的富集效率

5．2 甜叶菊微卫星引物多态性检测及应用

5．2．1 微卫星位点多态性评价

5．2．2 甜叶菊种间进化分析

5．3 近缘物种通用性检测

5．4 微卫星标记的应用

6 展望

参考文献

8 作者简介