Development of microsatellite markers for common bean (Phaseolus vulgaris L.) based on screening of non-enriched, small-insert genomic libraries

摘要

Microsatellite markers are useful genetic tools for a wide array of genomic analyses although their development is time-consuming and requires the identification of simple sequence repeats (SSRs) from genomic sequences. Screening of non-enriched, small-insert libraries is an effective method of SSR isolation that can give an unbiased picture of motif frequency. Here we adapt high-throughput protocols for the screening of plasmid-based libraries using robotic colony picking and filter preparation. Seven non-enriched genomic libraries from common bean genomic DNA were made by digestion with four frequently cutting restriction enzymes, double digestion with a frequently cutting restriction enzyme and a less frequently cutting restriction enzyme, or sonication. Library quality was compared and three of the small-insert libraries were selected for further analysis. Each library was plated and picked into 384-well plates that were used to create high-density filter arrays of over 18 000 clones each, which were screened with oligonucleotide probes for various SSR motifs. Positive clones were found to have low redundancy. One hundred SSR markers were developed and 80 were tested for polymorphism in a standard parental survey. These microsatellite markers derived from non-SSR-enriched libraries should be useful additions to previous markers developed from enriched libraries.Les microsatellites constituent des outils génétiques utiles pour une grande gamme d'analyses génomiques bien que leur développement prenne du temps et nécessite l'identification de séquences simples répétées (SSR) au sein des séquences génomiques. Le criblage de banques à inserts courts sans enrichissement préalable représente une méthode efficace pour isoler des SSR, laquelle peut livrer un portrait de la fréquence des motifs qui soit sans biais. Dans ce travail, les auteurs adaptent des protocoles à haut débit pour robotiser le prélèvement des colonies et la préparation des membranes au cours du criblage de banques de plasmides. Un jeu de sept banques génomiques non-enrichies préparées à partir de l'ADN génomique du haricot fragmenté par sonication ou encore digéré avec quatre enzymes coupant fréquemment ou une double digestion avec ces enzymes et une enzyme coupant moins souvent. La qualité de banques a été comparée et trois des banques à inserts courts ont été retenues pour analyse ultérieure. Chaque banque a été étalée et les colonies disposées dans des plaques à 384 puits, lesquelles ont servi à préparer les membranes à haute densité comprenant plus de 18 000 clones. Ces membranes ont été ensuite criblées avec des sondes oligonucléotidiques pour les différents motifs SSR. Il a été observé que les clones positifs présentaient une faible redondance et 100 marqueurs SSR ont été mis au point dont 80 ont été testés pour le polymorphisme sur un jeu de parents. Ces microsatellites dérivés de banques non-enrichies devraient s'avérer un ajout utile aux marqueurs développés précédemment à partir de banques enrichies.