阳离子多肽--硬脂酸嫁接物基因给药系统研究

摘要

阳离子多肽-硬脂酸嫁接物具有较丰富的正电荷，可通过静电作用与质粒DNA(plasmid DNA，pDNA)进行复合，为实现有效的体外基因转染和体内抗肿瘤疗效提供了极大的可能性。本研究构建了阳离子多肽-硬脂酸/pDNA复合物和聚乙二醇修饰多肽-硬脂酸/pDNA复合物基因给药系统，考察了其基本理化性质，体外转染效率，体内抗肿瘤疗效以及细胞内涵体逃逸过程。 阳离子多肽-硬脂酸嫁接物（cationic peptide stearate，STR-Pep）系通过多肽氨基末端的氨基与硬脂酸羧基发生酰胺化反应共轭连接而成，醛基化聚乙二醇则通过醛基与多肽赖氨酸残基上的游离氨基发生反应而生成聚乙二醇修饰的多肽-硬脂酸嫁接物(PEG modified cationic peptide stearate，PEG-STR-Pep)。以核磁共振氢谱确证两种嫁接物的化学结构，芘荧光法测定临界胶束浓度，透射电镜观察胶束的粒径以及形态学特征，噻唑蓝法考察嫁接物细胞毒性。 分别制备STR-Pep/pDNA复合物和PEG-STR-Pep/pDNA复合物，以透射电子显微镜观察复合物的粒径及形态特征，水平凝胶电泳分析嫁接物胶束与DNA的密接程度。以pEGFP-C1作为报告基因，HEK293，SKOV-3，MCF-7，Hela细胞为模型细胞，以荧光倒置显微镜观察嫁接物胶束介导的绿色荧光蛋白表达，并以流式细胞仪定量测定其转染效率。以pGL-3质粒为报告基因，定量考察嫁接物胶束介导的体外转染水平。同时，考察了STR-Pep/pDNA和PEG-STR-Pep/pDNA基因给药系统的体外细胞转染毒性。为了进一步确证多肽中组氨酸的促内涵体逃逸作用，以6-羧基荧光素（FAM荧光）标记pDNA，以Lyso-Tracker标记细胞内内涵体和溶酶体，观察由STR-Pep携载的pDNA在细胞内实现内涵体逃逸的过程。以荷SKOV-3裸鼠为模型动物，以pPEDF(plasmid of pigment epithelium-derivedfactor)为治疗基因，考察STR-Pep/pPEDF基因给药系统的体内抗肿瘤药效学。 因为STR-Pep嫁接物和PEG-STR-Pep嫁接物均具有显著的胶束特性以及较好的基因转染效率，考虑以载药胶束与目的基因结合实现针对肿瘤的协同治疗。本研究以碱基阿霉素(doxorubicin hydrochloride)为模型药物，以透析法制备STR-Pep/DOX和PEG-STR-Pep/DOX载药胶束给药系统;以超滤离心-有机溶剂提取法测定载药胶束中阿霉素的药物含量;以透射电镜观察载药胶束的形态及粒径大小;以SKOV-3、A549、HepG2细胞为模型细胞，评价阿霉素载药胶束的体外药效学。同时，制备了STR-Pep/DOX/pDNA和PEG-STR-Pep/DOX/pDNA复合给药系统，考察其在HepG2细胞中的转染效率。 研究结果表明，通过酰胺化反应和亲和取代反应分别得到了STR-Pep嫁接物和PEG-STR-Pep嫁接物，核磁共振氢谱确证了STR-Pep和PEG-STR-Pep嫁接物的化学组成。STR-Pep和PEG-STR-Pep嫁接物具有良好的理化性质，临界胶束浓度分别为182μg/mL和212μg/mL。透射电镜观察结果显示STR-Pep和PEG-STR-Pep嫁接物胶束粒径大小分别为10-20 nm和50-60 nm，且具有均匀的球型。STR-Pep和PEG-STR-Pep嫁接物胶束复合pDNA的能力比较强，在水平凝胶电泳实验中，均可以比较低的质量比(w/w=1，w/w=2)完全阻滞pDNA。制备的STR-Pep/pDNA和PEG-STR-Pep/pDNA基因给药系统则成功实现了目的基因的体外转染，STR-Pep/pDNA基因给药系统在正常细胞系HEK293和肿瘤细胞系SKOV-3，MCF-7和HeLa中均达到了较高的转染效率及转染水平，在部分肿瘤细胞系中的转染能力已经非常接近于甚至超越了LipofectamineTM2000。PEG-STR-Pep/pEGFP基因转染系统则在HEK293细胞系中介导了明显的绿色荧光蛋白表达。在体内抗肿瘤药效学研究中，STR-Pep/pDNA基因给药系统取得了比较好的疗效。同时，STR-Pep和PEG-STR-Pep嫁接物胶束对于阿霉素具有比较高的携载能力，包封率分别达到了54.1％和60.8％，STR-Pep/DOX/pEGFP和PEG-STR-Pep/DOX/pEGFP复合给药系统在体外转染实验中显示了一定的转染能力和发展潜力，相信随着研究的深入，将会取得较好的协同治疗效果。

目录

声明

致谢

摘要

引言

第1章 阳离子多肽-硬脂酸嫁接物(STR-Pep)的合成及理化性质研究

1．1 试剂与仪器

1．1．1 试剂

1．1．2 仪器

1．2 实验方法

1．2．1 STR-Pep嫁接物核磁共振分析

1．2．2 STR-Pep嫁接物临界胶束浓度测定

1．2．3 STR-Pep嫁接物胶束形态观察

1．2．4 STR-Pep嫁接物胶束的荧光标记

1．2．5 细胞培养

1．2．6 STR-Pep嫁接物胶束细胞摄取研究

1．2．7 STR-Pep嫁接物胶束细胞毒性研究

1．3 结果分析与讨论

1．3．1 STR-Pep嫁接物的结构确证

1．3．2 STR-Pep嫁接物的临界胶束浓度

1．3．3 STR-Pep嫁接物胶束的粒径及透射电子显微镜观察

1．3．4 STR-Pep嫁接物的细胞摄取研究

1．3．5 STR-Pep嫁接物的细胞毒性研究

1．4 小结

第2章 STR-Pep／pDNA复合物的制备及基因转染评价

2．1 试剂与仪器

2．1．1 试剂

2．1．2 仪器

2．2 实验方法

2．2．1 STR-Pep／pDNA复合物纳米粒的制备

2．2．2 STR-Pep／pDNA复合物的凝胶阻滞分析

2．2．3 STR-Pep／pDNA复合物的透射电子显微镜观察

2．2．4 细胞培养

2．2．5 STR-Pep／pDNA复合物的细胞摄取

2．2．6 STR-Pep／pEGFP复合物的体外转染毒性

2．2．7 STR-Pep／pEGFP复合物体外细胞转染定性研究

2．2．8 STR-Pep／pEGFP复合物体外细胞转染效率定量研究

2．2．9 STR-Pep／pGL-3复合物体外细胞转染水平定量研究

2．2．10 STR-Pep／pDNA复合物内涵体逃逸研究

2．2．11 STR-Pep／pPEDF复合物体内抗肿瘤药效学评价

2．3 结果与讨论

2．3．1 STR-Pep／pDNA复合物的凝胶阻滞分析

2．3．2 STR-Pep／pDNA复合物的透射电子显微镜观察

2．3．3 STR-Pep／pDNA复合物的细胞摄取

2．3．4 STR-Pep／pDNA复合物的细胞毒性

2．3．5 STR-Pep／pEGFP复合物体外细胞转染实验

2．3．6 STR-Pep／pEGFP复合物体外细胞转染率的测定

2．3．7 STR-Pep／pGL-3复合物体外细胞转染率定量研究

2．3．8 STR-Pep／pDNA复合物内涵体逃逸研究

2．3．9 STR-Pep／pPEDF复合物体内抗肿瘤药效学评价

2．4 小结

第3章 聚乙二醇修饰阳离子多肽-硬脂酸嫁接物(PEG-STR-Pep)基因载体研究

3．1 试剂与仪器

3．1．1 试剂

3．1．2 仪器

3．2 实验方法

3．2．1 PEG-STR-Pep嫁接物合成

3．2．2 PEG-STR-Pep嫁接物结构鉴定

3．2．3 PEG-STR-Pep嫁接物临界胶束浓度测定

3．2．4 PEG-STR-Pep嫁接物胶束透射电子显微镜观察

3．2．5 细胞培养

3．2．6 PEG-STR-Pep嫁接物胶束细胞毒性研究

3．2．7 PEG-STR-Pep／pDNA复合物的凝胶阻滞分析

3．2．8 PEG-STR-Pep／pDNA复合物的透射电子显微镜观察

3．2．9 PEG-STR-Pep／pEGFP复合物体外细胞转染实验

3．3 结果分析与讨论

3．3．1 PEG-STR-Pep嫁接物的合成与结构确证

3．3．2 PEG-STR-Pep嫁接物的临界胶束浓度

3．3．3 PEG-STR-Pep嫁接物胶束的透射电子显微镜观察

3．3．4 PEG-STR-Pep嫁接物的细胞毒性研究

3．3．5 PEG-STR-Pep／pDNA复合物凝胶阻滞实验

3．3．6 PEG-STR-Pep／pDNA复合物的透射电子显微镜观察

3．3．7 PEG-STR-Pep／pEGFP复合物体外细胞转染实验

3．4 小结

第4章 STR-Pep，PEG-STR-Pep嫁接物胶束的肿瘤化疗药物与基因药物的协同治疗研究

4．1 试剂与仪器

4．1．1 试剂

4．1．2 仪器

4．2 实验方法

4．2．1 载药胶束STR-Pep／DOX、PEG-STR-Pep／DOX的制备

4．2．2 透射电镜观察载药胶束STR-Pep／DOX、PEG-STR-Pep／DOX的形态

4．2．3 载药胶束STR-Pep／DOX、PEG-STR-Pep／DOX中阿霉素含量测定

4．2．4 细胞培养

4．2．5 载药胶束STR-Pep／DOX、PEG-STR-Pep／DOX的体外细胞药效学研究

4．2．6 STR-Pep／DOX／pEGFP、PEG-STR-Pep／DOX／pEGFP复合物体外细胞转染实验

4．3 结果与讨论

4．3．1 载药胶束STR-Pep／DOX、PEG-STR-Pep／DOX的制备

4．3．2 载药胶束STR-Pep／DOX、PEG-STR-Pep／DOX的透射电镜观察

4．3．3 载药胶束STR-Pep／DOX、PEG-STR-Pep／DOX中阿霉素含量测定

4．3．4 载药胶束STR-Pep／DOX、PEG-STR-Pep／DOX的体外细胞药效学研究

4．3．5 STR-Pep／DOX／pEGFP、PEG-STR-Pep／DOX／pEGFP复合物体外细胞转染实验

4．4 小结

5 结论

参考文献

综述 非病毒基因载体设计中的难点与策略

作者简历