共表达β-1,3-1,4-葡聚糖酶和β-1,4-木聚糖酶重组酿酒酵母的构建及其性能的应用研究

摘要

啤酒酿造特别是纯生啤酒的酿造中，高分子物质β-葡聚糖、阿拉伯木聚糖、蛋白质等不仅增加了啤酒粘度还极易堵塞过滤装置，造成过滤困难，影响生产。啤酒酿造中，高分子化合物含量越高，助滤剂硅藻土的使用量就越大。全球啤酒行业每年消耗的硅藻土是惊人的，初步计算每年硅藻土的使用量在200万吨-300万吨之间，这不仅需要企业付出大量成本，也给环境带来大量的污染。因而，研究如何降低啤酒的粘度，改善啤酒的易滤性，已成为业界和相关科研工作者亟待解决的问题之一。现有的科学研究和生产实践已经证明，啤酒酿造工艺中添加β-1，3-1，4-葡聚糖酶和β-1，4-木聚糖酶可以降低啤酒中β-1，3-1，4-葡聚糖和阿拉伯木聚糖的含量，从而降低啤酒粘度，是改善啤酒易滤性的可行途径之一。
　　本研究从改造发酵菌株出发，采用基因工程技术，构建表达β-1，3-1，4-葡聚糖酶和β-木聚糖酶的基因工程酵母，赋予重组酵母降解啤酒中葡聚糖和阿拉伯木聚糖的能力。尝试通过酿酒酵母在发酵过程中的作用改善啤酒过滤困难的问题。研究结果如下:
　　第一，构建了组成型分泌表达β-1，3-1，4-葡聚糖酶(GluZ)和β-1，4-木聚糖酶(XylB)的酿酒酵母基因工程菌。通过对商品化酵母穿梭质粒YEplac181的改造，构建了组成型分泌表达葡聚糖酶和木聚糖酶的重组质粒载体，该载体的表达盒包含了克隆自酿酒酵母基因组的PGK1启动子、MFa1信号肽、ADH1终止子序列，以及来自PUG6质粒的遗传霉素G418抗性基因KanMX,构建了组成型启动子PGK1调控的酵母分泌表达载体YEplac181-PMAK。将全基因合成的β-1，4-木聚糖酶基因(XylB)和来自YEplac181-KPMBT质粒的β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因(GluZ)克隆到YEplac181-PMAK上，构建了分泌表达XylB的YEplac181-PMXAK质粒和分泌表达GluZ的YEplac181-PMGAK质粒。分别将重组质粒YEplac181-PMXAK和YEplac181-PMGAK转化S.cerevisiaeWZ65，构建了分泌表达XylB和GluZ的酿酒酵母基因工程菌S.cerevisiaePMXAK和S.cerevisiaePMGAK;同时将重组质粒YEplac181-PMXAK和YEplac181-PMGAK共同转化S.cerevisiaeWZ65，构建了共分泌表达XylB和GluZ的酿酒酵母基因工程菌S.cerevisiaePMG-XAK，经透明圈实验证实三株重组酵母均可以分泌表达有活性的重组酶XylB和GluZ。摇瓶培养60h测得三株重组酵母的发酵液中酶活力分别为:S.cerevisiaePMXAK产XylB酶活为45.4U/mL;S.cerevisiaePMGAK产GluZ酶活为17.9U/mL;S.cerevisiaePMG-XAK共表达XylB和GluZ的酶活分别为21.7U/mL和8.7U/mL。
　　第二，构建了组成型展示表达XylB和GluZ的酿酒酵母基因工程菌。以YEplac181-PMAK为出发质粒，分别克隆了XylB、GluZ以及凝集素C端320个aa的锚定序列，构建了展示表达XylB和GluZ的表达载体YEplac181-PMXAAK和YEplac181-PMGAAK。分别将重组质粒YEplac181-PMXAAK和YEplac181-PMGAAK转化S.cerevisiaeWZ65，构建了展示表达XylB和GluZ的酿酒酵母基因工程菌S.cerevisiaePMXAAK和S.cerevisiaePMGAAK;同时将重组质粒YEplac181-PMXAAK和YEplac181-PMGAAK转化S.cerevisiaeWZ65，构建了共展示表达XylB和GluZ的酿酒酵母基因工程菌S.cerevisiaePMG-XAAK，经透明圈实验证实在三株重组酵母中两种酶均为有活性的展示表达。摇瓶培养60h测得三株重组酵母的发酵液中XylB和GluZ的活力分别为:S.cerevisiaePMXAAK产XylB酶活为8.9U/mL;S.cerevisiaePMGAAK产GluZ酶活为4.1U/mL;S.cerevisiaePMG-XAAK共表达XylB和GluZ的酶活分别为4.2U/mL和2.3U/mL。
　　第三，构建了诱导型展示表达XylB和GluZ的酿酒酵母基因工程菌。以YEplac181-PMGAAK和YEplac181-PMXAAK为出发质粒，克隆了源自酵母基因组的GAL1启动子，构建了诱导型启动子GAL1控制的展示表达载体YEplac181-PMGAAK和YEplac181-PMXAAK。分别将重组质粒YEplac181-GMXAAK和YEplac181-GMGAAK转化S.cerevisiaeWZ65，构建了展示表达XylB和GluZ的酿酒酵母基因工程菌S.cerevisiaeGMXAAK和S.cerevisiaeGMGAAK;同时将重组质粒YEplac181-GMXAAK和YEplac181-GMGAAK转化S.cerevisiaeWZ65，构建了共展示表达XylB和GluZ的酿酒酵母基因工程菌S.cerevisiaeGMG-XAAK，经透明圈实验证实三株重组酵母均可以展示表达有活性的重组酶XylB和GluZ。摇瓶培养60h测得三株重组酵母的发酵液中酶活力分别为:S.cerevisiaeGMXAAK产XylB酶活为15.6U/mL;S.cerevisiaeGMGAAK产GluZ酶活为7.3U/mL;S.cerevisiaeGMG-XAAK共表达XylB和GluZ酶活分别为7.6U/mL和3.4U/mL。
　　第四，本文对重组酵母分泌表达和展示表达的XylB和GluZ的酶学性质进行了研究。结果表明:(1)重组酶XylB具有专一的水解β-1，4-木糖糖苷键活力，GluZ具有专一的水解β-1，3-1，4-葡萄糖糖苷键活力。(2)重组酵母菌株S.cerevisiaePMXAK、S.cerevisiaePMXAAK和S.cerevisiaeGMXAAK所产XylB的最适反应温度均为50℃;重组酵母菌株S.cerevisiaePMGAAK和S.cerevisiaeGMGAAK展示表达的GluZ最适反应温度是50℃;S.cerevisiaePMGAK分泌表达的GluZ最适反应温度是40℃。上述6种重组酶在10℃-50℃时都具有较高的热稳定性，在最适反应温度下保温1h后仍可保持70％以上的活力(3)重组酵母菌株S.cerevisiaePMXAK、S.cerevisiaePMXAAK和S.cerevisiaeGMXAAK所产XylB最适反应pH为5.0;重组菌株S.cerevisiaePMGAK、S.cerevisiaePMGAAK和S.cerevisiaeGMGAAK所产GluZ最适反应pH为6.0。上述6种重组酶在偏酸性环境中（pH3.0和pH4.0）时具有较好的稳定性。
　　第五，本文对重组酵母的发酵性能和发酵中降低啤酒发酵液粘度的效果进行了研究。结果表明:(1)重组菌与出发菌株相比较，生长性能略有下降，但是对啤酒的表观发酵度和真实发酵度影响不大。(2)重组菌粗酶液具有较好的降解麦汁葡聚糖和木聚糖的能力，麦汁粘度随葡聚糖或木聚糖含量的降低而下降。(3)三株共表达葡聚糖酶和木聚糖酶的重组菌在主发酵过程中都能不同程度的降低麦汁的粘度，其中分泌表达菌株降解能力最好，诱导型展示表达菌株降解能力最差。
　　第六，为考察酿酒酵母基因工程菌株的生产性能进行了实验室小规模酿酒试验。重组菌株酿造的啤酒口味纯正，各项理化指标均达到啤酒国家标准。重组酿酒酵母在啤酒主发酵和后发酵中使麦汁中的β-葡聚糖和阿拉伯木聚糖含量降低了60％-70％，与对照组S.cerevisiaeWZ65相比，啤酒粘度下降27％以上，麦汁中β-葡聚糖从312mg/L降至106mg/L和121mg/L,达到了管敦仪等人提出的啤酒在膜过滤除菌前β-葡聚糖含量应低于150mg/L的要求。

目录

声明

论文说明

摘要

名词缩写表

本文构建的基因工程菌株信息一览表

第一章 文献综述

1 前言

2 啤酒酿造的原辅料及特性

2．1 啤酒酿造的主要原料——大麦

2．2 啤酒酿造的辅助原料

2．3 大麦和麦芽中与啤酒酿造有关的酶类

3 啤酒酿造工艺

3．1 原料粉碎

3．2 糖化

3．3 发酵

3．4 后酵

3．5 过滤

4 啤酒过滤技术

4．1 硅藻土过滤法

4．2 膜过滤技术

4．3 错流微过滤技术

5 啤酒过滤问题产生的原因及解决措施

5．1 啤酒过滤问题产生的原因

5．2 解决啤酒过滤困难的措施

6 β-1，3-1，4-葡聚糖酶的研究进展

6．1 β-1，3-1，4-葡聚糖酶的来源

6．2 β-1，3-1，4-葡聚糖酶的酶学性质

6．3 β-1，3-1，4-葡聚糖酶的克隆表达和热稳定性研究

6．4 β-1，3-1，4-葡聚糖酶的检测方法

6．5 β-1，3-1，4-葡聚糖酶的应用

7 β-1，4-木聚糖酶的研究进展

7．1 β-1，4-木聚糖酶的来源

7．2 β-1，4-木聚糖酶的酶学性质

7．3 β-1，4-木聚糖酶的克隆表达

7．4 β-1，4-木聚糖酶的检测方法

7．5 β-1，4-木聚糖酶的应用

8 酿酒酵母展示表达系统

8．1 酿酒酵母细胞表面展示表达系统的构成及原理

8．2 常用酿酒酵母展示表达系统

8．3 酿酒酵母细胞表面展示表达系统的应用

8．4 酿酒酵母细胞表面展示表达系统存在的缺陷

9 选题背景和研究思路

第二章 分泌型表达β-1，3-1，4-葡聚糖酶和β-1，4-木聚糖酶重组酵母的构建

1 材料与仪器

1．1 菌株和质粒

1．2 引物

1．3 主要试剂

1．4 培养基

1．5 主要仪器设备

2 实验方法

2．1 密码子优化和基因合成

2．2 PCR反应条件

2．3 PCR产物纯化

2．4 DNA片段的酶切与连接

2．5 琼脂糖凝胶电泳

2．6 大肠杆菌质粒提取

2．7 大肠杆菌感受态细胞制备

2．8 质粒转化大肠杆菌宿主

2．9 基因测序

2．10 酵母基因组DNA提取

2．11 酿酒酵母的感受态制备和质粒的电击转化

2．12 重组酵母的筛选及PCR检测

2．13 酵母分泌表达载体的构建过程

2．14 透明圈实验

2．15 β-1，4-木聚糖酶活力的测定

2．16 β-1，3-1，4-葡聚糖酶活力的测定

3 结果与分析

3．1 β-1，4-木聚糖酶基因的优化和合成

3．2 β-1，4-木聚糖酶基因的扩增

3．3 β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因的扩增

3．4 PGK1启动子基因的扩增

3．5 MFα1基因的扩增

3．6 PGK1-MFα1基因的连接和扩增

3．7 ADH1终止子基因的扩增

3．8 KanMX的扩增

3．9 PGK1-MFα1片段的克隆

3．10 ADH1终止子基因的克隆

3．11 KanMX基因的克隆

3．12 β-1，4-木聚糖酶基因的克隆

3．13 β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因的克隆

3．14 分泌表达β-1，4-木聚糖酶酿酒酵母基因工程菌的构建

3．15 分泌表达β-1，3-1，4-葡聚糖酶的酿酒酵母基因工程菌的构建

3．16 共表达β-1，4-木聚糖酶和3-1，3-1，4-葡聚糖酶酿酒酵母基因工程菌的构建

3．17 β-1，4-木聚糖酶和β-1，3-1，4-葡聚糖酶分泌表达

4 讨论与小结

4．1 讨论

4．2 小结

第三章 组成型展示表达β-1，3-1，4-葡聚糖酶和β-1，4-木聚糖酶重组酵母的构建

1 材料与仪器

1．1 菌株和质粒

1．2 引物

1．3 主要试剂

1．4 培养基

1．5 主要仪器设备

2 实验方法

2．1 PCR反应条件

2．2 PCR产物纯化

2．3 DNA片段的酶切与连接

2．4 琼脂糖凝胶电泳

2．5 大肠杆菌质粒提取

2．6 大肠杆菌感受态细胞制备

2．7 质粒转化大肠杆菌宿主

2．8 基因测序

2．9 酵母基因组DNA提取

2．10 酿酒酵母的感受态制备和质粒的电击转化

2．11 重组酵母的筛选及PCR检测

2．12 酵母展示表达载体的构建

2．13 透明圈实验

2．14 展示表达β-1，4-木聚糖酶活力的测定

2．15 展示表达β-1，3-1，4-葡聚糖酶活力的测定

2．16 酵母工程菌株细胞组分的制备

3 结果与分析

3．1 β-1，4-木聚糖酶基因的扩增

3．2 β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因的扩增

3．3 α-agglutinin基因的扩增

3．4 β-1，4-木聚糖酶基因的克隆

3．5 α-agglutinin基因的克隆

3．6 β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因的克隆

3．7 展示表达β-1，4-木聚糖酶的酿酒酵母基因工程菌的构建

3．8 展示表达β-1，3-1，4-葡聚糖酶的酿酒酵母基因工程菌的构建

3．9 共展示表达β-1，4-木聚糖酶和β-1，3-1，4-葡聚糖酶的酿酒酵母基因工程菌的构建

3．10 β-1，4-木聚糖酶和β-1，3-1，4-葡聚糖酶在细胞表面的展示表达

4 讨论与小结

4．1 讨论

4．2 小结

第四章 诱导型展示表达β-1，3-1，4-葡聚糖酶和β-1，4-木聚糖酶重组酵母的构建

1 材料与仪器

1．1 菌株和质粒

1．2 引物

1．3 主要试剂

1．4 培养基

1．5主要仪器设备

2 实验方法

2．1 PCR反应条件

2．2 PCR产物纯化

2．3 DNA片段的酶切与连接

2．4 琼脂糖凝胶电泳

2．5 大肠杆菌质粒提取

2．6 大肠杆菌感受态细胞制备

2．7 质粒转化大肠杆菌宿主

2．8 基因测序

2．9 酵母基因组DNA提取

2．10 酿酒酵母的感受态制备和质粒的电击转化

2．11 重组酵母的筛选及PCR检测

2．12 展示表达载体的构建流程

2．13 酵母基因工程菌诱导产酶方法

2．14 透明圈实验

2．15 β-1，4-木聚糖酶活力的测定

2．16 β-1，3-1，4-葡聚糖酶活力的测定

2．17 酵母工程菌株细胞组分的制备

3 结果与分析

3．1 GAL1启动子基因的扩增

3．2 构建YEplac181-GMXAAK质粒

3．3 构建YEplac181-GMGAAK质粒

3．4 展示表达β-1，4-木聚糖酶酿酒酵母基因工程菌的构建

3．5 展示表达β-1，3-1，4-葡聚糖酶酿酒酵母基因工程菌的构建

3．6 共展示表达β-1，4-木聚糖酶和β-1，3-1，4-葡聚糖酶的酿酒酵母基因工程菌的构建

3．7 重组酿酒酵母展示表达β-1，4-木聚糖酶和β-1，3-1，4-葡聚糖酶

4 小结与讨论

4．1 讨论

4．2 小结

第五章 重组β-1，3-1，4-葡聚糖酶和β-1，4-木聚糖酶的性质

1 材料与仪器

1．1 菌株

1．2 主要试剂

1．3 培养基

1．4 仪器设备

2 实验方法

2．1 β-1，4-木聚糖酶活力的测定

2．2 β-1，3-1，4-葡聚糖酶活力的测定

2．3 标准曲线制作

2．4 β-1，4-木聚糖酶和β-1，3-1，4-葡聚糖酶的表达

2．5 酵母细胞的收集

2．6 β-1，3-1，4-葡聚糖酶酶学性质研究

2．7 β-1，4-木聚糖酶酶学性质研究

3 结果与分析

3．1 重组β-1，3-1，4-葡聚糖酶的底物专一性

3．2 重组β-1，4-木聚糖酶的底物专一性

3．3 β-1，4-木聚糖酶的最适反应温度

3．4 β-1，4-木聚糖酶的热稳定性

3．5 β-1，4-木聚糖酶的最适反应pH

3．6 β-1，4-木聚糖酶的pH稳定性

3．7 β-1，3-1，4-葡聚糖酶的最适反应温度

3．8 β-1，3-1，4-葡聚糖酶的热稳定性

3．9 β-1，3-1，4-葡聚糖酶的最适反应pH

3．10 β-1，3-1，4-葡聚糖酶的pH稳定性

4 讨论与小结

4．1 讨论

4．2 小结

第六章 基因工程菌株的发酵性能

1 材料与仪器

1．1 主要试剂

1．2 培养基

1．3 菌株

1．4 主要仪器设备

2 实验方法

2．1 生长曲线

2．2 发酵力试验

2．3 凝聚性试验

2．4 热死灭温度试验

2．5 木聚糖含量与麦芽汁粘度的关系

2．6 葡聚糖含量与麦芽汁粘度的关系

2．7 酿酒酵母基因工程菌主发酵过程中分解木聚糖和葡聚糖的研究

3 实验结果

3．1 生长曲线

3．2 发酵性能

3．3 凝聚性

3．4 热死灭温度

3．5 麦芽汁粘度与β-葡聚糖含量的关系

3．6 麦芽汁粘度与木聚糖含量的关系

3．7 木聚糖在啤酒主发酵过程中的降解

3．8 葡聚糖在啤酒主发酵过程中的降解

4 小结与讨论

4．1 讨论

4．2 小结

第七章 基因工程菌株酿酒试验

1 材料与方法

1．1 酵母菌种及原料

1．2 主要仪器

2 实验方法

2．1 麦汁培养基的制备

2．2 啤酒酿造试验方法

2．3 理化指标及性能分析

3 结果与分析

3．1 啤酒理化指标的测定结果

3．2 酵母菌性能测试

4 讨论与小结

第八章 结论与展望

1 结论

1．1 具有降解木聚糖和葡聚糖的酿酒酵母基因工程菌的构建

1．2 重组酶的酶学性质

1．3 酿酒酵母基因工程菌的性能

2 展望

参考文献

致谢

作者简历