γ-氨基丁酸对梨果实青霉病抗性的诱导作用及相关机理研究

摘要

病原菌侵染是导致果实采后损失的主要因素之一。在当前国内外广泛探索的非杀菌剂型病害控制方法中，诱导抗性技术和理论是研究的热点。γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA）作为一种新型食品功能因子，已在食品工业中得到了广泛应用。近年来的研究表明，GABA作为一种重要的植物代谢产物，在果实采后逆境条件下的代谢调控、抗性应激反应和环境胁迫应答中可能均起到了关键作用。但是关于GABA对果实抗病性影响的研究却尚为空白。本课题重点分析了GABA对梨果实青霉病抗性的诱导作用及其主要影响因素;并通过分析GABA对病原菌、对梨果实抗性相关的生理生化反应和抗性相关的基因表达、对处理后果实的超微结构、品质和对梨果实抗性物质代谢、GABA代谢途径的影响等，探讨了GABA诱导梨果实抗性的生物学机制。主要研究结果如下:
　　1.GABA对梨果实抗性诱导的作用规律
　　1～1000μg/mlGABA在梨果实伤口处对青霉病没有直接抑制作用，但能诱导梨果实对扩展青霉（Penicillium expansum）的抗性，其效力与GABA的浓度、GABA的处理时间以及病原菌浓度等因素密切相关。在常温条件下100μg/mlGABA预先处理伤口组织24h后可以显著降低104spores/mlP.expansum引起的梨果实青霉病，发病率相比对照组降低了54.5％;而在低温贮藏的早期（接入病原菌后的第16天），可以完全抑制病害的发生;整果处理也显示了较好的控制效力，病害发生率降低了22.2％。但GABA的诱导抗性效能随病原菌浓度的升高而下降。
　　此外，GABA处理后的梨果实在一个月的贮藏期的品质指标与对照组相比没有发生显著性变化，说明GABA处理并没有对梨果实品质产生负面影响。
　　2.GABA对病原菌和梨果实的作用机理
　　2.1、GABA对扩展青霉在体外和体内孢子萌发的影响
　　1～1000μg/mlGABA在PDA固体培养基和PDB液体培养基中均不能显著抑制P.expansum的生长;而在果实体内，当100μg/mlGABA处理与病原菌接种时间间隔提高到24h后，可以显著而强烈的抑制组织伤口处P.expansum的孢子萌发。这些结果暗示:GABA能够降低梨果实青霉病的机制可能主要与其能诱导梨果实的抗性有关。
　　2.2、GABA对梨果实组织超微结构的影响
　　采用SEM和TEM电镜观察GABA处理对梨果实伤口组织超微结构的影响，发现GABA诱导处理后再接入P.expansum的果实组织细胞壁较厚，组织形态和细胞器保存基本完好，而对照组内含物由于大量渗出而减少，且已成碎片状，部分果实组织和细胞出现崩溃和死亡的现象。以上结果说明GABA能在细胞组织水平上增强梨果实对病原菌的抗性。
　　2.3、GABA对梨果实抗性相关生理指标的影响
　　通过测定8个与果实防御系统相关的生理生化指标并利用激光共聚焦显微镜观察ROS在组织细胞爆发情况表明，GABA诱导处理后再接入P.expansum果实组织的多酚氧化酶(PPO)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)活性相比GABA或P.expansum单独处理组均呈现显著而快速提高的趋势，而细胞过量的活性氧(ROS)被有效清除，丙二醛(MDA)含量降低，同时GABA处理还诱导了与病原菌直接作用的几丁质酶(CHI)和β-1，3-葡聚糖酶(GLU)活性的显著增强。以上结果表明，GABA处理能激发梨果实抗性相关防御酶系和病程相关酶活性，并且可能存在Priming机制。
　　2.4、GABA对梨果实抗性相关基因表达情况的影响
　　利用RT-PCR对梨果实的PpPPO，PpPOD家族基因、PpPAL、PpCHI家族基因和PpGLU进行扩增后，均得到预期大小的单一目的片段。GABA和P.expansum处理后PpPOD3表达量下调，PpPOD4、PpCHI2和PpCHI3表达量没有显著变化。家族基因基因结构上的差异最终导致功能上的不同，由此推测PpPOD3、PpPOD4、PpCHI2、PpCHI3可能不参与果实抗性防御反应中POD、CHI酶活性的调控，因此选择PpPOD1和PpCHI4为果实防御系统的抗性调控目的基因，利用qPCR对其进行定量测定。
　　qPCR结果证明GABA+P.expansum处理显著诱导梨果实的PpPPO、PpPOD1、PpPAL、PpCHI4以及PpGLU基因表达，并展现出更强更快的激发效果，明显快于和高于P.expansum单独处理的组织，而GABA单独处理后防御基因表达没有发生上调，这在分子水平上进一步解释了GABA能通过调控梨果实抗性基因表达而诱导果实抗性和可能存在Priming机制。
　　2.5、GABA对梨果实体内抗性物质代谢和GABA支路代谢的影响
　　利用GC-MS检测GABA、P.expansum单独或联合处理梨果实伤口后的物质代谢，结果表明在GABA与P.expansum联合处理的果实组织中，肉桂酸和香豆素含量均显著高于对照组、GABA、或P.expansum单独处理组的含量。这与通过生理生化分析和基因表达分析得到的GABA与P.expansum联合处理能显著诱导果实组织PpPAL基因表达，调控PAL活性升高的结果一致。因此PAL代谢可能与GABA诱导梨果实抗性的机理密切相关。
　　此外，在P.expansum的生物胁迫下，GABA处理还显著激发了GABA的代谢途径:在GABA与P.expansum联合处理的果实中琥珀酸、谷氨酸盐和腐胺含量均显著高于对照组、GABA或P.expansum单独处理组，并发现延胡索酸生成，而在其他三种处理后的果实中没有检测到;同时也发现果糖含量在P.expansum侵染后显著增加，这可能与病原菌产生的致病因子细胞壁降解酶有关;木糖醇含量在P.expansum侵入组织中较高，但没有发现其他的多元醇存在同样的趋势，这可能由于不同的多元醇对胁迫信号的响应存在差异所致。

目录

声明

摘要

简写对照表

第一章 文献综述

1．1 前言

1．2 果实采后真菌病害概述

1．2．1 果实采后真菌病害的分类

1．2．2 果实采后病原真菌侵染寄主的主要方式和过程

1．2．3 果实采后真菌病害的防治方法

1．3 果实采后诱导抗性研究概述

1．3．1 果实采后诱导抗性机制

1．3．2 果实采后诱导抗性因子

1．4 果实对病原真菌侵染的抗性反应机制

1．4．1 果实组织细胞结构变化

1．4．2 产生抗真菌物质

1．4．3 活性氧爆发

1．4．4 防御酶系统与病程相关蛋白

1．4．5 防御基因的表达

1．5 Priming机制概述

1．6 GABA研究进展

1．6．1 GABA概述及生理功能

1．6．2 GABA制备方法

1．6．3 GABA在植物体内的代谢

1．6．4 GABA在植物体内生物学功能

1．6．5 GABA在果实采后病害的研究现状

1．7 本课题的研究目的与意义

1．8 本课题研究内容及技术路线

1．8．1 主要研究内容

1．8．2 技术路线

第二章 GABA对梨果实抗性的诱导作用

2．1 前言

2．2 材料与方法

2．2．1 主要试剂及培养基

2．2．2 果实及病原菌

2．2．3 实验仪器

2．2．4 实验方法

2．3 结果与分析

2．3．1 GABA对梨果实青霉病直接抑制的影响

2．3．2 SA和GABA不同浓度对梨果实青霉病抗性诱导的影响

2．3．3 GABA不同处理时间对梨果实青霉病抗性诱导的影响

2．3．4 在不同病原菌孢子浓度下GABA对梨果实青霉病抗性诱导的影响

2．3．5 GABA整果处理对梨果实青霉病的控制效果

2．3．6 冷藏条件下GABA处理对梨果实青霉病的控制效果

2．3．7 GABA对病原菌在PDB和PDA培养基上生长的影响(体外试验in vitro)

2．3．8 GABA对病原菌在果实伤口处生长的影响(体内试验in vivo)

2．4 讨论

第三章 GABA对梨果实超微结构和生理生化机制的影响

3．1 前言

3．2 材料与方法

3．2．1 主要试剂

3．2．2 果实及病原菌

3．2．3 实验仪器

3．2．4 实验方法

3．3 结果与分析

3．3．1 GABA对梨果实超微结构的影响

3．3．2 GABA对梨果实生理的影响

3．3．3 GABA对梨果实品质的影响

3．4 讨论

3．4．1 GABA对梨果实超微结构的影响

3．4．2 GABA对梨果实PPO、PAL活性的影响

3．4．3 GABA对梨果实SOD、POD、CAT活性和ROS的影响

3．4．4 GABA对梨果实CHI和GLU活性的影响

3．4．5 GABA诱导果实抗性中的Priming机制

3．4．6 GABA对梨果实品质的影响

第四章 GABA对梨果实抗性相关基因表达情况的影响

4．1 前言

4．2 材料与方法

4．2．1 主要试剂

4．2．2 果实及病原菌

4．2．3 实验仪器

4．2．4 实验方法

4．3 结果与分析

4．3．1 RT-PCR初步筛选抗性基因并验证引物特异性

4．3．2 qPCR定量测定抗性相关基因的表达水平

4．4 讨论

第五章 GABA对梨果实体内物质代谢的影响

5．1 前言

5．2 材料与方法

5．2．1 主要试剂

5．2．2 果实及病原菌

5．2．3 实验仪器

5．2．4 实验方法

5．3 结果与分析

5．3．1 GABA处理对梨果实体内抗性物质代谢和GABA支路组分变化的影响

5．4 讨论

第六章 结论与展望

6．1 主要研究结论

6．1．1 GABA对梨果实抗性诱导的作用规律

6．1．2 GABA对病原菌和梨果实作用机理

6．2 主要创新点

6．3 下一步研究展望

参考文献

致谢

作者简介