基于ITS-1弓形虫基因的环介导等温扩增(LAMP)检测技术的研究及应用

摘要

弓形虫是一种呈世界性分布的机会性致病原虫，可以寄生于包括人在内的几乎所有温血动物的有核细胞内。由其引起的弓形虫病，对动物以及人类危害较严重。免疫系统正常的人感染弓形虫病后，呈隐性感染状态，通常不会呈现明显的临床症状;免疫力低下的人群（如艾滋病患者、骨髓移植和器官移植病人等）感染该病后，会产生严重的病变，甚至会引起死亡。妊娠期母畜感染该病，常可引起流产、死胎、以及胎儿眼部、大脑和中枢神经损伤，会对畜牧业造成重大的经济损失。目前针对弓形虫的检测技术，存在着操作复杂、敏感性低，假阳性率高，需要昂贵的仪器设备等缺点，而基层单位迫切需要一种既有良好的特异性和敏感性，又简便实用的检测方法。环介导等温扩增技术(LAMP)具有操作简便、反应迅速、灵敏性和特异性高等优点，能满足目前的这种迫切需求。
　　本研究基于弓形虫RH株的核糖体DNA内转录间隔区基因1(ITS-1)序列，设计特异性引物，建立了针对弓形虫的普通PCR检测方法。该普通PCR检测体系特异性强，不能在犬新孢子虫、棘球蚴、旋毛虫、李斯特杆菌、猪链球菌基因组DNA中扩增出条带;敏感性高，该方法可检测到的弓形虫DNA最低量为90fg/μL。
　　同时基于弓形虫RH株的ITS-1基因序列，设计6条特异性识别靶序列上8个区域的引物，经过LAMP扩增和体系优化，建立检测弓形虫的LAMP方法。该LAMP方法在65℃恒温条件下，经过30 min扩增即可完成反应。特异性试验结果显示，该方法与犬新孢子虫、棘球蚴、旋毛虫、李斯特杆菌、猪链球菌等病原体的基因组DNA不会发生交叉反应。敏感性试验结果表明，其最低能检测到的弓形虫DNA量为0.9 fg/μL，与前面建立的普通PCR检测方法相比，该LAMP检测方法的敏感性要高100倍。该检测体系的成功建立为兽医基层单位提供弓形虫病的临床诊断和流行病学调查的技术支持。
　　为了解浙江省杭州、金华地区猪中弓形虫病的流行现状，更好地为弓形虫病的防治及猪肉食品卫生安全的保障提供科学的依据，我们从浙江省杭州、金华地区屠宰场采集118份猪肉膈肌样本，应用建立的普通PCR和LAMP检测体系对采集的118份膈肌样本进行检测。调查结果显示上述地区猪肉中弓形虫阳性率较高，其中LAMP检测方法检出16份阳性样本，阳性率为13.56％;普通PCR方法检出11份阳性样本，阳性率为9.32％。鉴于目前尚无十分有效的弓形虫疫苗可以预防该病，因此制定合理的防控方案对于上述地区的弓形虫病预防方面具有重要意义。对猪肉样品的检测数据进行统计学分析，结果显示猪肉中弓形虫阳性率与饲养管理方式相关，不同地区阳性率之间差异显著，与猪的品种则无显著差异。
　　综上所述，本研究基于ITS-1基因建立了一种可靠的LAMP检测方法，其特异性强，敏感性比普通PCR要高，为进一步将该方法转化成商品化试剂盒奠定基础。运用该方法对浙江省州、金华地区屠宰场的猪肉样本进行检测，并对试验数据进行统计学分析。应用结果表明，该LAMP方法具有特异性好、敏感性高、操作简便的特点，具备广阔的应用前景。

目录

声明

论文说明

摘要

前言

第一部分 文献综述

第一章 刚地弓形虫与弓形虫病

1 弓形虫病原形态

2 弓形虫生活史

3 流行病学

4 临床症状及病理变化

5 临床诊断

6 弓形虫病的防治

7 小结

第二章 弓形虫诊断技术的研究进展

1 病原学检测

2 血清学检测

3 分子生物学检测

4 小结

第三章 环介导等温扩增技术的原理和应用

1 LAMP方法的基本原理

2 LAMP方法的优点

3 LAMP方法的应用

4 小结

第二部分 研究内容

第四章 弓形虫PCR检测方法的建立

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

第五章 弓形虫LAMP检测方法的建立

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

第六章 应用LAMP方法检测猪肉中的弓形虫

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

结论

附录1 溶液配制

附录2 英文缩写注释

攻读硕士学位期间的主要成果

参考文献

致谢