三叶青根结线虫鉴定及紫背天葵对南方根结线虫的抗性机制研究

摘要

根结线虫主要分布在热带和亚热带地区及设施栽培中，通过口针穿刺植物细胞，注射由食道腺分泌的致病因子，除了正常的（反复）侵染之外还会同其他病原物发生复合侵染。长期以来，由于化学杀线虫剂的滥用，引起了害虫的抗药性及对环境污染等诸多问题，明确病原线虫的种类、筛选抗性的植物材料等系根结线虫病治理的重要举措。
　　本研究在实验室植物的根结线虫抗性鉴定实验的基础之上，对来自三叶青上的一根结线虫进行了形态学和分子鉴定，系统研究了紫背天葵对南方根结线虫的抗性特点及抗性机制，主要研究结果概述如下:
　　1、结合形态学和分子特征，对来自三叶青根部病的病原线虫进行了鉴定。实验对J2及成熟雌虫的阴花纹分别进行了形态学观察和相关主要形态值的测量，有关的主要形态学特征和形态测量值与南方根结线虫基本吻合;通过对rDNA的ITS区、28s的D2A/D3B区的扩增和序列比较，有关序列与南方根结线虫的同源性较高，达到99％和99％的相似度，利用南方根结线虫特异性SCAR引物MiF/R的PCR反应也获得了阳性结果;综合形态学和分子特征确定来自三叶青上的根结线虫为南方根结线虫(M.incongnita)，这也是首次报道三叶青受南方根结线虫的侵染和危害，证明三叶青是南方根结线虫的新寄主。
　　2、探索优化了紫背天葵扦插繁殖的方法并采用1月龄苗作为实验材料;利用酸性品红和苔酚兰染色方法着重研究了南方根结线虫在紫背天葵根内的侵染和发育状况，在J2接种量(1.46*104)条件下观察了接种根结线虫后紫背天葵根和根结线虫的联合发育情况。线虫在12dpi开始相对大规模的入侵，0％-0.1％的入侵率，在18dpi和27dpi时根内线虫数目相对较多，35dpi时已经大为减少;27dpi到35dpi之间就出现了接近60％的线虫消亡，在整个过程中并没有龄期超过J3的线虫被检测到，伴随着线虫的入侵，植物根的维管束组织也发生着分蘖、沉积加厚和碎块化等异化过程;
　　3、设计了一系列引物并利用多种PCR技术验证了获得了一对高效的简并引物，扩增获得了紫背天葵的NBS-LRR抗病同源序列79条，通过对序列进行比对分析后选取并分析了具有代表性的9条NBS-LRR抗性序列在线虫J2侵染之后45天中的基因表达情况:扩增获得的NBS-LRR抗病同源序列全部属于TIR家族，选定出来的序列进行表达分析中的5条在线虫侵染中有一定水平的表达上调，剩余3条(GbD-gnl6，GbD-gnl16，GbD-gn137)在线虫侵染后的表达被压抑。

目录

声明

致谢

摘要

第一章 根结线虫及其与植物的关系

1．根结线虫的分类及取食位点的建立

1．1 根结线虫的危害和巨型细胞的发育

1．2 根结线虫的分类

2．植物的线虫抗性研究进展

2．1 NBS-LRR类抗病基因的在植物生活史中的地位

2．2 植物线虫抗性基因的研究进展

第二章 发病三叶青线虫病原的鉴定

1 材料

1．1 三叶青发病材料及病原的扩大培养

1．2 主要试剂与仪器

2 主要实验方法

2．1 根结线虫的分育

2．2 根结二龄幼虫临时玻片的制作

2．3 成熟雌虫会阴花纹的制作

2．4 形态学观察及形态学参数的测量

2．5 线虫DNA的提取

2．6 PCR反应和电泳检测

2．7 目的DNA片段核苷酸序列的获得

3 病原线虫的鉴定结果

3．1 危害症状及形态学特征

3．2 分子生物学鉴定结果

4 结论和讨论

第三章 紫背天葵对南方根结线虫的抗性机制研究

1 材料方法

1．1 主要试剂耗材与仪器

1．2 供试根结线虫

1．3 紫背天葵植株培植

1．4 根结线虫二龄幼虫收集及接种

1．5 紫背天葵对南方根结线虫的抗性表现

1．6 引物设计

1．7 紫背天葵基因组DNA的提取

1．8 紫背天葵根组织总RNA的提取

1．9 梯度PCR、筒并PCR和反转录PCR(RT-PCR．)

1．10 cDNA第一链的合成及RT-PCR扩增

1．11 NBS-LRR抗病同源序列的获得、分析

1．12 实时荧光定量PCR(qRT-PCR．)及数据处理

2 结果

2．1 紫背天葵抗性表现

2．2 NBS-LRR序列系统发育分析

2．3 NBS-LRR抗病同源序列在线虫侵染过程中的表达分析

4 分析讨论

4．1 紫背天葵的南方根结线虫抗性的组织学机制

4．2 紫背天葵NBS-LRR抗病同源序列的特征及表达特点

5 总结展望

参考文献

附录