钾、甜菜碱缓解烟草镉毒害基因型差异及耐镉相关miRNA表达差异分析

摘要

本研究利用水培试验，系统地研究了钾和甜菜碱对烟草镉毒害的缓解效应及作用机理，并探讨了镉胁迫下烟草miRNA表达的基因型差异。主要研究结果如下:
　　1.钾对烟草镉毒害的缓解效应
　　参试烟草基因型K326，水培试验，研究镉处理5d和10d后K0、K1、K2、K3(0、0.25、0.5、1mMK)4个浓度钾对5μM Cd胁迫下烟草生长、矿质元素吸收与分布、光合参数及抗氧化酶活性等的影响。结果表明，镉胁迫条件下，钾缓解镉毒害具有剂量效应，中等浓度钾处理(K2+Cd)烟草生理性状好于其它3个镉处理;地上部和根部镉含量分别比其它3个镉处理平均低15.8％与12.9％，烟草叶片中的锌和铁含量较高;其SPAD值、光合参数和抗氧化酶活性优于其它3个镉处理，而MDA含量则显著低于其它3个镉处理。本试验结果显示，钾缓解镉毒害的机理主要包括:降低镉含量，减少镉对植株的毒害;促进烟草生长和物质的量积累，增强其对镉的耐性;增加抗氧化酶活性（SOD、CAT与APX活性提高），降低膜脂过氧化作用（MDA含量降低）。
　　2.甜菜碱对烟草镉毒害的缓解作用及基因型差异
　　参试烟草基因型贵烟1号（镉敏感基因型）和云烟2号（耐镉基因型），水培试验，设对照（基本培养液）、Betaine(500μM Betaine)、Cd（5μM Cd）和Cd+Betaine4个处理，研究外源甜菜碱对镉胁迫下烟草生长和生理的影响及基因型差异。结果表明，叶面喷施500μM甜菜碱可以显著缓解烟草镉毒害。与单一镉处理(Cd)相比，喷施甜菜碱后(Cd+Betaine)烟草地上部与根部镉含量分别显著降低13.0％、11.7％（贵烟1号）和13.7％、11.8％（云烟2号），MDA含量降低;同时显著缓解镉胁迫对根尖细胞活力的抑制;缓解因镉胁迫出现的胞质松散，膜系统模糊，嗜锇颗粒增加，基粒数目减少且片层结构松散的现象;增加根尖细胞中的空泡数量和体积。此外，叶面超微结构扫描及光合仪数据分析发现，喷施甜菜碱会使气孔关闭，蒸腾速率下降。甜菜碱缓解镉毒害的原因主要有:甜菜碱降低烟草对镉的吸收与转运，在根部形成大量空泡束缚镉的移动，使烟草主动降低镉对自身的毒害;甜菜碱增强镉胁迫下烟草的光合作用并保护PSⅡ，提高根系的活力，增加烟草物质的合成与积累;保护蛋白质和代谢酶的活性，促进烟草叶片和根系中镉诱导产生的ROS清除，减少镉对细胞膜的损伤。
　　3.镉胁迫下烟草miRNA表达的基因型差异
　　参试烟草基因型贵烟1号和云烟2号，水培试验设0（对照）和50μM Cd处理，镉胁迫5d取根系进行了高通量miRNA测序，结果得到属于53个家族的164条已知miRNA和29条新miRNA。通过比较保守miRNA相对表达量后发现，镉处理后贵烟1号和云烟2号中表达量均显著上调和下降的miRNA分别有22和6条，有12条miRNA在贵烟1号中表达量上调在云烟2号中变化不明显，8条miRNA在贵烟1号中不变在云烟2号中下调。同时，13条新miRNA在镉处理后表达发生显著变化。通过靶基因预测，发现527个保守miRNA的靶基因与195个新miRNA的靶基因，发现镉胁迫下miR164等在云烟2号中上调表达但贵烟1号中不变或下调的miRNA靶基因很有可能与两基因型的耐镉性差异有关。COG功能分类显示miRNA的靶基因功能涉及广泛的生物学过程。最后，我们利用qRT-PCR对6条miRNA进行验证，验证结果与高通量测序结果一致。