球孢白僵菌AMPK蛋白激酶基因BbSNF1和α-葡萄糖转运蛋白基因BbAGT1的功能分析

摘要

球孢白僵菌(Beauveria bassiana)作为昆虫病原微生物，不仅在农业害虫防治方面有着极其重要的应用潜力，同时还是研究真菌生长发育及其致病机制的良好模型。
　　本文主要研究了球孢白僵菌AMPK蛋白激酶BbSNF1调控生长发育与致病力的机制以及补充研究了α-葡萄糖苷转运基因BbAGT1在对生防真菌球孢白僵菌碳源利用、产孢以及毒力方面的影响，研究结果如下。
　　球孢白僵菌AMPK蛋白激酶BbSNF1的功能研究 AMPK蛋白激酶在真菌中高度保守，球孢白僵菌BbSNF1基因编码区全长2230bp，编码702个氨基酸，包括一个在SNF1所有同源蛋白中存在的PKinase结构域。为进一步鉴定球孢白僵菌BbSNF1的功能，我们构建了基因敲除菌株和回补菌株。通过与野生菌株和回补菌株的表型对比发现，在菌株生长方面，敲除菌株△BbSNF1在八种不同碳源和四种不同氮源培养基上生长明显减弱;代谢方面，在不同碳源培养基中，尤其是在葡萄糖、蔗糖和海藻糖作为唯一碳源培养时，敲除菌株培养液液酸度增加明显;并且在测定菌液中四种有机酸含量时发现，敲除菌株的乳酸、丙酮酸以及柠檬酸的含量增加，而草酸的含量降低;产孢能力方面，分别以SDA为基础培养基和以CZA为基础培养基时，敲除株的分生孢子量下降趋势明显，且在产孢结构方面，BbSNF1基因的敲除明显延缓了产孢结构的形成时间及产孢结构的形态;在菌株毒力方面，分别进行体表浸泡法处理和血腔注射法处理时，敲除菌株相比野生株其半致死时间分别延长了75％和25％，导致昆虫毒力的下降;在调控基因转录方面，被检测的17个编码几丁质酶的基因表达量中13个呈下调趋势，48个编码蛋白水解酶的基因中有18个明显抑制，海藻糖为碳源的培养基中转录的14个单羧酸转运基因中表达量上调的有9个，蔗糖为碳源的培养基中转录的14个单羧酸转运基因中表达量上调的有8个，此外，当以葡萄糖为碳源培养时，在检测的40个糖苷转运蛋白基因中有31个表达量呈下降趋势，以海藻糖为碳源培养时，糖苷转运蛋白基因也有28个表达量下降。由此可见，球孢白僵菌蛋白激酶BbSNF1在调控球孢白僵菌的生长发育、营养代谢，尤其是菌株毒力方面有着重要的作用。
　　球孢白僵菌的芽生孢子作为另一种可侵染的细胞形式，在病原真菌侵染过程中有着不可替代的作用。本文研究了在有机氮源和无机氮源的培养下BbSNF1调控球孢白僵菌芽生孢子的生长发育的情况。研究结果表明，在两种培养条件下敲除菌株相对野生菌株而言芽生孢子的产量和生物量都呈下降趋势，并且有机氮源培养时敲除株的芽生孢子个体更小。对野生株、敲除株和回补菌株的芽生孢子产孢结构的观察发现，敲除菌株的产孢结构出现的更晚，且萌发形态有不同程度的变异。昆虫体内芽生孢子形态的观察结果显示，敲除菌株细胞呈现生长较弱状态，易被昆虫血细胞吞噬。由此可见，球孢白僵菌BbSNF1在调控芽生孢子的生长发育方面有着重要的作用。
　　α-葡萄糖苷转运蛋白BbAGT1调控球孢白僵菌生长、产孢以及毒力丝状真菌中糖苷转运蛋白在介导真菌吸收利用营养物质生长方面，起着重要的作用。海藻糖是昆虫血淋巴中的主要碳源，因而昆虫病原真菌对海藻糖的利用能力是决定其在昆虫血腔内成功定殖、致病的重要因素之一。本文在前人构建了敲除菌株△BbAGT1的基础上，构建了回补菌株，并补充分析了球孢白僵菌中α-葡萄糖苷转运蛋白基因BbAGT1的功能。生物学表型分析表明BbAGT1基因的缺失导致了孢子萌发以及不同碳源上生长和产孢能力的减弱。昆虫毒力实验表明传统浸泡处理和昆虫体腔注射处理时，敲除菌株△BbAGT1对昆虫大蜡螟致死时间较野生菌株更长，即引起毒力的下降。基因转录分析揭示了BbAGT1的缺失可引起其它糖转运蛋白基因的表达量的变化方面的差异。总之，实验结果进一步揭示了球孢白僵菌α-糖苷转运蛋白在真菌对糖的利用、生长和致病力方面的潜在作用。

目录

声明

论文说明

致谢

摘要

第一章 文献综述

1．1 昆虫病原真菌球孢白僵菌生物学研究现状

1．2 SNF1／AMPK途径的研究现状

1．2．1 SNF1激酶的结构

1．2．2 SNF1催化活性的调控

1．2．3 SNF1蛋白激酶在酵母菌株中的功能研究

1．2．4 丝状真菌中SNF1的功能研究现状

1．3 糖苷转运蛋白AGT1的研究现状

1．4 研究目的和意义

第二章 球孢白僵菌BbSNF1调控生长发育与致病力的功能研究

2．1 材料

2．1．1 菌株和质粒

2．1．2 试剂

2．2 方法

2．2．1 核酸提取

2．2．2 BbSNF1克隆及序列分析

2．2．3 载体构建

2．2．4 载体农杆菌转化及根癌农杆菌介导的真菌转化

2．2．5 转化子的鉴定

2．2．6 表型测定

2．2．7 敲除菌株与野生菌株的相关基因转录水平分析

2．2．8 毒力测定

2．3 结果

2．3．1 BbSNF1序列分析与载体构建

2．3．2 碳氮源对生长的影响

2．3．3 液体培养条件下菌株代谢变化

2．3．4 菌株分生孢子产孢变化

2．3．5 毒力测定

2．3．6 转录分析

2．4 讨论

第三章 BbSNF1在芽生孢子的生长发育中的功能分析

3．1 方法

3．1．1 不同类型碳氮源对芽生孢子发育的影响

3．1．2 芽生孢子产孢结构的观察

3．1．3 芽生孢子在昆虫血腔中形态变化

3．2 结果

3．2．1 无机氮源条件下不同菌株芽生孢子的变化情况

3．2．2 有机氮源条件下不同菌株芽生孢子的变化情况

3．2．3 芽生孢子产孢结构变化

3．2．4 昆虫血腔中芽生孢子形态的变化

3．3 讨论

第四章 α-葡萄糖苷转运基因BbAGT1在球孢白僵菌中的功能分析

4．1 材料方法

4．1．1 生物学表型分析

4．1．2 糖苷转运蛋白基因的qRT-PCR转录分析

4．1．3 数据和序列分析

4．2 结果

4．2．1 BbAGT1转运蛋白序列分析

4．2．2 BbAGT1的表型特征

4．2．3 BbAGT1在昆虫毒力上的影响

4．2．4 球孢白僵菌糖转运蛋白的转录分析

4．3 讨论

结语

参考文献