两种药用植物响应光酶诱导次生代谢关键酶活性的研究

摘要

课题组前期研究表明，应用光酶诱导技术可以显著提高药用植物体内活性成分的含量，或者产生新的高活性的次生代谢产物。本课题以圆锥铁线莲叶片和桑叶为研究对象，应用光酶诱导技术诱导圆锥铁线莲叶片产生香豆素，诱导桑叶产生桑辛素和Diels-Alder加合物。从这两种药用植物叶片中提取粗酶，分别加入香豆素和Diels-Alder加合物生物合成途径的前体，辅以HPLC-DAD分析技术，确认了生物合成活性成分关键酶的存在，从酶学水平阐释了光酶诱导技术提高药用植物体内活性成分含量的作用机制。
　　以圆锥铁线莲叶为研究对象，将离体的圆锥铁线莲叶片进行光酶诱导处理，诱导后样品在温度25℃，避光培养，时间分别为6h、12h、18h、24h和36h，对照组样品也在同样环境下培养36h。采用不同pH值的提取液从圆锥铁线莲叶片中提取粗酶，加入推测的香豆素生物合成途径的前体，进行酶促反应。当加入推测的底物p-香豆酸，7-羟基香豆素，水杨酸和苯甲酸之后，底物没有消耗，也没有合成新的化合物，而当加入咖啡酸之后，体系有新的色谱峰产生;从不同时间点提取出来的粗酶的活性各不相同，但都能催化咖啡酸发生反应。催化此反应的酶在对照组的叶片中也能检测到，活性较处理组低。可以初步判断，光酶诱导圆锥铁线莲产生的三个香豆素化合物，可能是通过咖啡酸途径生物合成的，是生物合成上游的限速步骤。
　　以桑叶为研究对象，将离体的桑叶叶片进行光酶诱导处理，诱导后样品在温度为25℃，避光培养，培养时间分别为36h，对照组的样品也在同样环境下培养。采用pH=8的提取液从桑叶中提取粗酶，加入推测的Diels-Alder加合物的生物合成途径的前体，进行酶促反应，分析反应前后指纹图谱的变化，确定桑叶体内存在Diels-Alderase，光酶诱导前后桑叶提取的粗酶，加入预测的底物morachalcone和桑辛素C，在酶促反应开始的2h内，酶促反应进行非常顺利，生成了预测的Diels-Alder加合物chalcomoracin，并且随着恒温孵育时间的延长，morachalcone和桑辛素C逐渐消耗掉，而chalcomoracin含量则随之显著上升。研究显示光酶诱导前后的桑叶都存在着Diels-Alderase，能够催化morachalcone和桑辛素C生物合成chalcomoracin，并且该酶的活性较高。然而，预测底物morachalcone和桑辛素N没有发生上述生物合成反应。由此可以推测，Diels-Alderase具有高度特异性，仅能催化特定结构的底物发生[4+2]环加成反应。
　　采用光酶诱导技术能使诱导后的药用植物产生高活性的次生代谢物，本研究通过提取药用植物体内的粗酶，加入其生物合成的前体，通过酶促反应联合HPLC-DAD分析技术，确认了生物合成活性成分关键酶的存在，为从酶学水平阐释活性化合物生物合成机制打下良好基础，对于定向提高植物中次生代谢产物含量的新方法具有积极的推动作用。

目录

声明

致谢

摘要

第一章 绪论

1．1 研究背景

1．2 光酶诱导方法在植物次生代谢产物中的研究

1．2．1 光酶诱导方法对植物次生代谢产物及其生物合成途径的影响

1．3 圆锥铁线莲及香豆素次生代谢产物研究进展

1．3．1 圆锥铁线莲研究迸展

1．3．2 香豆素的生物合成途径和酶学研究

1．4 桑叶及Diels-Alder型加合物的生物合成途径研究进展

1．4．1 桑叶和Dieis-Alder型加合物研究概述

1．4．2 桑属植物中Diels-Alder型加合物的生物合成途径研究进展

1．5 研究目的和意义

1．6 研究内容

第二章 圆锥铁线莲中香豆素生物合成途径的研究

2．1 引言

2．2 圆锥铁线莲叶粗酶活性HPLC检测法的可行性研究

2．2．1 植物来源与鉴定

2．2．2 实验试剂及耗材

2．2．3 实验仪器

2．2．4 样品处理

2．2．5 粗酶液的制备

2．2．6 粗酶液可溶性蛋白质含量测定

2．2．6 酶促反应底物的选取

2．2．7 酶促反应

2．2．8 圆锥铁线莲粗酶指纹图谱的建立

2．3 实验结果

2．3．1 圆锥铁线莲叶粗酶提取与酶促反应条件的建立

2．3．2 圆锥铁线莲光酶诱导前后粗酶提取液指纹图谱的建立与对比

2．3．3 质谱分析

2．4 分析讨论

第三章 桑叶中Diesl-Alderase的研究

3．1 引言

3．2 桑叶粗酶活性HPLC检测法的可行性研究

3．2．1 植物来源与鉴定

3．2．2 实验试剂及耗材

3．2．3 实验仪器

3．2．4 样品处理

3．2．5 粗酶液的制备

3．2．6 粗酶液可溶性蛋白质含量测定

3．2．7 酶促反应

3．2．8 桑叶粗酶指纹图谱的建立

3．3 实验结果

3．3．1 桑叶粗酶提取与酶促反应条件的建立

3．3．2 桑叶光酶诱导前后粗酶提取液指纹图谱的建立与对比

3．3．3 诱导桑叶粗酶加入单一底物酶促反应

3．3．4 诱导桑叶粗酶同时加入两个底物酶促反应

3．3．5 未诱导桑叶粗酶加入单一底物酶促反应

3．3．6 未诱导桑叶粗酶同时加入两个底物酶促反应

3．3．7 诱导前后桑叶粗酶同时加入morachalcone+桑辛素C酶促反应

3．4 分析讨论

第四章 总结与展望

4．1 总结

4．2 展望

参考文献

作者简历