酒精性肝病特异性miRNAs表达谱及下游调控基因研究

摘要

第一部分酒精性肝病组织特异性miRNAs表达谱及下游调控基因研究
　　背景：
　　酒精性肝病(ALD)是全球性慢性肝病的主要病因之一，常造成广泛的肝损伤，其范围包括单纯脂肪变性(AFL)，酒精性脂肪性肝炎(ASH)，肝纤维化，肝硬化甚至肝细胞癌。虽然脂肪变性是一种几乎完全良性的疾病，但是酒精性肝硬化与死亡率显著相关，预期寿命缩短。美国2007年最新监测报告显示，肝硬化是美国第12大死因，与酒精相关率达48％。在中国，我们的流行病学研究表明，浙江省ALD的患病率是3.94％。因此，开发有效的ALD的诊治工具具有重要临床意义。
　　新证据提示，miRNAs的异常表达将导致酒精性肝损伤的发展。例如，Tang等报道，乙醇诱导miR-212超表达，通过下调一个结合部位的主要成分ZO-1导致肠道通透性增加，而肠道通透性是ALD的一个关键病理生理因素。Yin等研究表明，慢性乙醇暴露将特异性诱导AML-12肝细胞和老鼠的肝脏中miR-217超表达，然后抑制肝脏SIRT1表达，最终导致肝细胞的脂肪堆积。用乙醇处理正常的人类肝细胞(N-Heps)和胆管细胞，会诱导miR-34a的表达显著增加，而miR-34a的超表达通过调节靶目标caspase-2和SIRT1减少乙醇诱导的凋亡。在乙醇饲养的老鼠的肝脏中miR-155和miR-132表达增加，与孤立肝细胞和枯否细胞中的表达增加一致。
　　此外，最近不少研究运用微阵列方法研究ALD的miRNAs的表达谱。Liu等在ALD患者中发现了26个miRNAs。进一步研究miRNA-基因网络显示，关键的miRNAs是hsa-miR-570, hsa-miR-122, hsa-miR-34b, hsa-miR-29c, hsa-miR-922和hsa-miR-185，后者负向调控大约79个下游靶基因以调节肝细胞免疫反应，炎症反应和谷胱甘肽代谢。同时慢性乙醇饲养改变了肝再生期间一些miRNAs的表达，包括miR-34a，miR-103，miR-107，miR-122和miR-21。Dolganiuc等研究发现与配对饲养的对照组相比，Lieber-deCarli酒精饮食上调酒精性脂肪性肝炎大鼠已知miRNAs的1％(如miR-705和miR-1224)和下调1％(如miR-182，miR-183和miR-199a-3p)。这些发现对ALD的诊断和治疗提供了有价值的线索。
　　然而，区分ALD的不同阶段中单纯性脂肪肝和酒精性脂肪肝炎的miRNAs的表达谱尚未报道。
　　材料和方法：
　　48只Sprague-Dawley大鼠（12周，160g-170g）随机分为四组:C12，AFL，C16和ASH。AFL和ASH大鼠用北京二锅头灌胃制模（浓度56％的酒精和17.86ml/kg每天一次），对照组给予生理盐水。12周和16周结束日大鼠股血管放血，常规检测血清ALT、AST、TG、GGT、TCh和肝脏TG含量。肝脏组织切片H-E染色，由奥林巴斯显微镜观察肝脂肪变性和炎症。
　　应用微阵列初筛和茎环RT-PCR验证的方法检测ALD大鼠模型中异常表达的miRNAs。再以微阵列显著性分析(SAM)和微阵列预测分析（PAM）计算显著异常表达的miRNAs。TargetScan、miRanda和PicTar共同用来预测miRNAs的靶基因。最后通过“DAVID”平台对这些靶基因进行GO功能分类和KEGG通路分析。
　　结果：
　　ALD不同阶段的AFL和ASH大鼠模型成功建立，并经血清学和病理变化证实。
　　微阵列芯片和茎环RT-PCR结果，ASH组与对照组相比，有16个miRNAs上调和13个miRNAs下调，而miR-129和miR-199 a-3p处于上调和下调miRNAs的最前列。AFL组和对照组相比，有5个miRNAs上调和8个miRNAs下调，而miR-200 c*和miR-93处于上调和下调miRNAs的最前列。
　　通过SAM和PAM进一步分析发现，区分ASH组和对照组的特异性miRNAs表达谱由6个下调miRNAs（miR-199a-3p，miR-214，miR-93，miR-146a，miR-191和let-7b）和6个上调miRNAs（miR-129，miR-490，miR-21*，miR-503，miR-183和miR-185*）组成。区分AFL组和对照组的特异性miRNAs表达谱由5个下调miRNAs(miR-93，miR-451，miR-221*，miR-17-5p和miR-146a)和3个上调miRNAs（miR-200c*，miR-490和miR-195*）组成。
　　通过靶基因预测分析发现，ASH组的下调miRNAs和上调miRNAs的靶基因分别为8个和61个，而AFL组的下调miRNAs和上调miRNAs的靶基因分别为20个和152个。
　　结论：
　　ASH的特异性miRNAs表达谱为6个下调miRNAs(miR-199a-3p，miR-214，miR-93，miR-146a，miR-191和let-7b)和6个上调miRNAs(miR-129，miR-490，miR-21*，miR-503，miR-183和miR-185*)。AFL的特异性miRNAs表达谱为5个下调miRNAs（miR-93，miR-451，miR-221*，miR-17-5p和miR-146a）和3个上调miRNAs（miR-200c*，miR-490和miR-195*）。
　　ASH的下调miRNAs和上调miRNAs的靶基因分别为8个和61个，而AFL的下调miRNAs和上调miRNAs的靶基因分别为20个和152个。
　　第二部分酒精性脂肪性肝炎血清潜在miRNAs标志物研究
　　背景：
　　酒精性肝病(ALD)被认为是肝硬化的主要原因之一，它包括酒精性脂肪肝、酒精性脂肪性肝炎(ASH)、肝纤维化和肝硬化。ALD的发病机制涉及到酒精及其代谢产物对肝细胞的影响，活性氧的诱导，炎症级联反应的激活和肠道通透性的失衡。ASH一直被视为ALD病程中最重要的阶段，因为它通常是不可逆转的，且造成肝硬化和肝细胞癌的风险大大增加。鉴于ALD全球增加的患病率及其在中国的高发率，因此，找到合适的诊断ASH的标志物具有重要临床意义。
　　miRNAs在所有多细胞生物均被发现且呈多样性，并发挥重要的生物功能。例如，组织miRNAs的异常表达，作为潜在的诊断工具，在人类癌症、非酒精性脂肪肝病(NAFLD)等疾病中被广泛报道。
　　既往的miRNAs研究主要基于组织水平。最近报道，血清和其他体液含有足够稳定的miRNAs印迹。因此，基于这一发现，学者研究了一些疾病包括癌症、药物性肝损和炎症的循环miRNAs。然而，迄今尚无ASH特异性循环miRNAs的研究。
　　材料和方法：
　　Sprague-Dawley大鼠(12周，160-170 g)被随机分为两组:ASH组（和对照组。ASH组大鼠用北京二锅头灌胃制模（浓度56％的酒精和17.86ml/kg每天一次），对照组给予生理盐水。16周结束日大鼠股血管放血处死。常规检测血清ALT、AST、TG和肝脏TG含量;肝脏组织切片Haematoxylin-Eosin染色，由奥林巴斯显微镜观察和评估肝脂肪变性和炎症。
　　以TRIzol试剂盒和miRNeasy试剂盒按照说明书常规提取组织和血清RNA。以Axon GenePix4000B微阵列扫描仪扫描芯片。得到的图像以GenePix Pro6.0software软件进行分析。以实时定量逆转录PCR验证芯片所发现的特异性改变的miRNA。对PCR所得到的原始-△CT结果通过log2转化实现数据正态化分布后，再分别SAM和PAM进行深入的生物信息学分析。
　　联合应用 miRNA-靶基因预测的开放进入平台(http://www.microrna.org/microrna/home.do)和靶基因扫描(http://www.targetscan.org/)生成miRNAs靶基因。然后，搜索GO分类和KEGG通路以研究靶基因功能注释和通路。
　　结果：
　　ASH大鼠模型成功建立，并经血清学和病理变化确认。
　　ASH组血清和对照组相比，有25个上调和7个下调miRNAs，而ASH组肝组织和对照组相比，有20个上调和14个下调miRNAs。MiRNA-208b-3p和miRNA-455*在血清中变化最大，而miRNA-129和miRNA-199a-3p在肝组织中变化最大。然而，只有4个miRNAs(miR-490，miR-185*，miR-199a-3p和miR-214)在血清和肝组织中均有显著改变。
　　为了缩小miRNAs范围，基于qRT-PCR的原始数据应用SAM分析发现ASH组和对照组相比，分别有18个上调血清miRNAs和5个下调血清miRNAs。进一步应用PAM方法发现区分ASH组和对照组的特异性miRNAs表达谱分别由8个上调和3个下调miRNAs组成。
　　进一步以GO功能分类和KEGG通路对SAM结果进行分析。共122个GO功能分类和144个KEGG通路在上调miRNAs中显著富集，其中离子运输、蛋白质运输、凋亡过程、脂质代谢过程和脂肪酸代谢过程是在GO功能分类的前列，而MAPK信号通路、PPAR信号通路、胰岛素信号通路和氧化磷酸化在KEGG通路的前列。同样，86个GO功能分类和104个KEGG通路在下调miRNAs中显著富集。其中，脂肪酸代谢、脂类代谢、细胞凋亡和胰岛素信号通路也位于前列。
　　结论：
　　区分ASH组和对照组的特异性的血清miRNAs表达谱，由8个上调miRNAs(rno-miR-539, rno-miR-490, rno-miR-484, rno-miR-135b, rno-miR-466c,rno-miR-208b-3p, rno-miR-761和rno-miR-384-5p)和3个下调miRNAs(rno-miR-214, rno-miR-203和rno-miR-199a-3p)组成。