卡波西肉瘤miRNA差异表达谱的筛选及miR-126-3p对卡波西肉瘤细胞株SLK生物学性状的影响及靶基因研究

摘要

研究背景：卡波西肉瘤是一个多中心间充质来源的肿瘤。1872年Moritz Kaposi首先报道，主要见于意大利人、犹太人、地中海起源的老年人，新疆是一个多民族聚居的地方，在中国超过90％的卡波西肉瘤发生在新疆。卡波西肉瘤发病机制目前并不清楚，许多研究已经证明人疱疹病毒8型是卡波西肉瘤最重要的病原体。虽然人疱疹病毒8型在新疆普通人群中有很高的流行率，但人疱疹病毒8型并不是唯一致病因素，由于缺乏基因学的研究，卡波西肉瘤在这个人群中发病机理尚不清楚。新疆特定的地理、民族、环境可能导致卡波西肉瘤的特殊特点。MicroRNAs(miRNAs)是19-25个核苷酸，单链的非蛋白质编码的RNAs，在生物进程中扮演着重要的角色。miRNAs通过靶mRNA基因3′非翻译区互补序列达到调控靶mRNA表达的目的。miRNAs的功能包括信号转导，细胞分化，细胞增殖和细胞凋亡。miRNAs在肿瘤中的作用非常重要。他们包括促癌miRNA和肿瘤抑制miRNAs，参与调节、增殖，血管生成等。miRNAs在癌症中有着独特的表达谱，因此miRNAs可以作为诊断和对治疗的分子靶标。
　　目的：（1）采用第七代miRCURYTM LNA Array(v.18.0)(Exiqon)芯片检测卡波西肉瘤miRNA差异表达谱。（2）人工合成miR-126-3p模拟物，抑制物等，对卡波西肉瘤细胞株SLK进行转染，通过一系列体外细胞生物学实验（细胞增殖、细胞迁移、侵袭、细胞凋亡及细胞周期）观察过表达或抑制miR-126-3p后对卡波西肉瘤细胞株SLK的生物性状的影响。（3）结合三种miRNA靶基因预测软件，发现miR-126-3p可与PIK3R2的3′UTR结合，因此推测PIK3R2极有可能为miR-126-3p的靶基因，本部分验证PIK3R2是miR-126-3p调控的靶基因。
　　方法：
　　一、卡波西肉瘤miRNA差异表达谱分析
　　选取6对2012年1月到2013年9月在我科就诊的卡波西肉瘤患者肿瘤和瘤旁组织，采用Trizol提取总RNA，分离并标记 miRNA后制成杂交液，与第七代miRCURYTM LNA Array(v.18.0)(Exiqon)芯片杂交，再经洗片、扫描及数据分析处理，获得差异表达miRNA。采用实时荧光定量PCR方法在18对配对的卡波西肉瘤肿瘤和瘤旁组织中验证部分差异表达的 miRNA，获得卡波西肉瘤 miRNA表达谱，并对上述miRNA的表达量在病理分型、HIV感染、HHV-8感染、皮损面积的差异性进行统计学分析。
　　二、miR-126-3p在卡波西肉瘤细胞株SLK中的功能研究
　　（1）优化转染条件：通过转染不同浓度的阳性对照测定 MTT值确定最佳转染浓度及最佳转染时间。（2）MTT检测细胞增殖活性：实验分模拟物组、抑制物组、阴性对照组、抑制物阴性对照组，转染后48h，在酶标仪上测定各孔的吸光度值(OD值)，比较各组细胞的增殖情况。（3）转染 miR-126-3p模拟物及抑制物后应用transwell小室，24小时后行苏木素染色观察细胞迁移、细胞侵袭生物学特性。（4）应用流式细胞仪检测转染miR-126-3p模拟物及抑制物48小时后各组细胞凋亡率及细胞周期。
　　三、miR-126-3p靶向调控PIK3R2的机制研究
　　（1）生物学软件预测miR-126-3p的靶基因。（2）运用qRT-PCR检测转染miR-126-3p模拟物、抑制物、阴性对照、抑制物阴性对照的SLK细胞PIK3R2的表达量，采用2-△△CT相对定量数据分析。（3）采用Western Blot方法检测转染了miR-126-3p模拟物及抑制物细胞中PIK3R2蛋白表达的改变。（4）合成预测靶点3’端非翻译区中含有目的 miR-126-3p位点的片段，将该片段克隆于荧光素酶报告基因载体pmiRGIO中，将PIK3R2突变型和野生型载体与miR-126-3p模拟物及抑制物共转染到293T细胞中，采用双荧光素酶报告基因检测荧光素酶活性。
　　结果：
　　一、卡波西肉瘤miRNA差异表达谱分析
　　（1）18对卡波西肉瘤均为维吾尔族，男女比例为17:1，平均年龄60.1±14.1岁。病程24.2±33.8月。11例CKS中HHV-8病毒感染率81.82%(9/11)。7例AIDS-KS中，6例患者感染HHV-8(85.71%)病毒。
　　（2）卡波西肉瘤肿瘤和瘤旁组织中存在差异表达miRNA，在3100个miRNA探针中，有170个差异表达的miRNA，包括69个上调和101个下调的miRNAs，最显著的上调miRNAs是miR-126-3p，miR-199a-3p，miR-16-5p和13个KSHV相关miRNAs。显著下调的miRNAs有miR-125b-1-3p和miR-1183。经qRT-PCR验证上述10个miRNAs在18对卡波西肉瘤肿瘤和瘤旁组织中的表达水平与芯片结果一致。
　　（3）经统计学分析显示，miR-125b-1-3p与HHV-8之间具有统计学意义(p=0.001)，miR-16-5p与HIV之间具有统计学意义(p=0.018)。
　　二、miR-126-3p在卡波西肉瘤细胞株SLK中的功能研究
　　（1）MTT检测结果显示：与阴性对照组比较，miR-126-3p mimic组可以抑制细胞增殖，抑制率为19.62%±1.68(P﹤0.05)。而抑制miR-126-3p在SLK细胞中的表达，则促进细胞增殖(12.42%±1.79)(P﹤0.05)，表明过表达 miR-126-3p明显抑制 SLK细胞增殖(P﹤0.01)。
　　（2）应用Transwell小室检测转染miR-126-3p mimic、inhibitor、阴性对照、抑制物阴性对照后细胞迁移的能力，过表达miR-126-3p降低了SLK细胞迁移和侵袭数目；低表达 miR-126-3p可以增加 SLK细胞迁移和侵袭数目(P＜0.05)。推测miR-126-3p可能具有抑制卡波西肉瘤细胞迁移和侵袭的能力。
　　（3）应用流式细胞仪检测miR-126-3p对SLK细胞周期的影响，miR-126-3p mimic转染组 G2/M期细胞所占比例[(30.75±0.64)%]明显高于阴性对照组[(4.70±0.99)%](P=0.00)，miR-126-3p mimic转染组S期细胞所占比例[(10.85±1.49)%]明显低于阴性对照组[(40.80±0.99)%](P=0.00)。miR-126-3p inhibitor转染组S期细胞所占比例[(52.50±2.69)%]明显高于阴性对照组和inhibitor阴性对照组[(40.10±1.27)%](P﹤0.05)，提示miR-126-3p可将SLK细胞阻滞于G2/M期，阻碍细胞进入分泌期。
　　（4）应用流式细胞仪检测miR-126-3p对SLK细胞凋亡的影响，转染了miR-126-3pmimic之后SLK细胞早期凋亡率增加，与NC组比较，其凋亡率分别为20.53%±1.70和9.67%±0.31，转染了miR-126-3p inhibitor后，SLK细胞早期凋亡率为11.10%±0.95,与NC组细胞凋亡率比较，其凋亡率未见明显改变，表明miR-126-3p能够促进SLK细胞凋亡。
　　三、miR-126-3p靶向调控PIK3R2的机制研究
　　（1）通过在线miRNA靶基因预测软件Mirbase，Miranda和Targetscan对miR-126-3p下游靶基因进行预测，取三个数据的交集，发现PIK3R2可能是miR-126-3p靶基因。
　　（2）与阴性对照组比较，过表达 miR-126-3p后 PIK3R2基因水平下降，转染miR-126-3p inhibitor后PIK3R2基因水平升高，推测miR-126-3p对PIK3R2具有调控作用。
　　（3）与阴性对照组比较，转染外源性miR-126-3p mimic到SLK细胞之后，细胞中PIK3R2蛋白表达水平明显减弱，反之，转染miR-126-3p inhibitor后，细胞中PIK3R2蛋白表达水平增强，说明miR-126-3p可负性调控PIK3R2蛋白的表达。
　　（4）与阴性对照组相比，miR-126-3p与野生型质粒共转染使萤火虫荧光素酶活性下降，荧光素酶相对比值下降(P<0.05)，而将 PIK3R2-3′UTR-MUT同 miR-126-3p共转染细胞后，荧光强度并无明显改变，无显著性差屏(P﹥0.05)。
　　结论：
　　(1)初步筛选出170个卡波西肉瘤相关的miRNA，包括69个上调和101个下调的miRNAs。经qRT-PCR验证miRNA基因芯片结果可靠，提示这些miRNAs与卡波西肉瘤的发病机制密切相关，在疾病进程中发挥着重要作用。
　　(2) miR-126-3p可以抑制细胞增殖，抑制细胞侵袭和迁移，促进细胞凋亡，诱导SLK细胞产生G2/M期阻滞，缩短S期细胞比率。推测miR-126-3p在卡波西肉瘤中可能起抑制类似抑癌基因的作用，负性调控卡波西肉瘤的生物学行为。
　　(3)生物信息学分析表明PIK3R2基因3'UTR与miR-126-3p的结合区域高度保守。miR-126-3p可下调PIK3R2基因的表达，负性调控PIK3R2蛋白的表达。双荧光素酶报告基因活性检测证实PIK3R2是miR-126-3p直接作用的靶基因。

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英文缩略词表

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前言

第一部分 卡波西肉瘤miRNA差异表达谱分析

1.材料与方法

2. 结果

3.讨论

4. 结论

第二部分 miR-126-3p对卡波西肉瘤细胞株SLK生物学特性的影响

1.材料与方法

2. 结果

3.讨论

4. 结论

第三部分miR-126-3p靶向调控PIK3R2的机制研究

1.材料与方法

2. 结果

3. 讨论

4. 结论

全文总结

参考文献

附录

致谢

中文综述: MicroRNAs在卡波西肉瘤发病机制中的研究进展