妊娠早期高雌激素暴露影响子代脂代谢表观遗传机制研究

摘要

本文对妊娠早期高雌激素暴露影响子代脂代谢表观遗传机制进行了研究。本研究分为四个部分：
　　第一部分：妊娠早期高雌激素暴露子代的生长发育和脂代谢追踪研究。
　　目的：研究妊娠早期高雌激素环境暴露的子代的生长发育和脂代谢状况，比较分析母体妊娠期的雌激素水平与子代血脂水平的相关性。
　　方法：本研究对2002年1月至2010年7月在浙江大学医学院附属妇产科医院出生的401例单胎子代儿童期进行随访，年龄为3-10岁，其中自然妊娠组142例（对照组），新鲜胚胎移植组153例（高雌暴露组，简称IVF-ET组），冷冻胚胎移植组(FET组)106例。随访的指标包括子代的基本情况，其母亲妊娠时期的情况，以及子代的血压、心率、空腹血脂、血常规等指标。IVF-ET组的母体雌激素测定日期是移植日及妊娠8周时，同期自然妊娠的母亲雌激素测定是在排卵后3-5天及妊娠8周。通过病案系统回顾性查阅随访子代的母亲移植日的雌激素水平，对二者进行相关性分析。
　　结果：排除出生体重、出生身长、孕周、性别、月龄、体重指数以及母亲妊娠年龄等干扰因素后，自然妊娠组、新鲜胚胎移植组、冷冻胚胎移植组子代的血常规指标、血压、心率无显著性差异，而子代血脂水平出现改变。新鲜胚胎移植组子代的总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇水平显著高于其他两组，而冷冻胚胎移植组和对照组无统计学差异，高密度脂蛋白胆固醇和甘油三酯在三组之间无统计学差异。新鲜胚胎移植组母亲妊娠期经过促排卵处理，其移植当日和妊娠第8周的雌激素水平都显著高于同期自然妊娠组，其子代的高胆固醇血症的发生率(10.53％)显著高于对照组(3.29％)，子代的总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇水平和母亲移植日的雌激素水平呈显著正相关，而子代高密度脂蛋白胆固醇和甘油三酯水平和母亲移植日的雌激素水平未呈现相关性。
　　结论：促排卵治疗的孕妇在妊娠早期处于一种超生理范围的高雌激素状态，是研究宫内高雌激素暴露的理想模型。母亲妊娠期间的高雌激素状态会导致子代儿童期的高血脂倾向，而冷冻技术对子代血脂水平无影响。宫内高雌激素暴露的子代儿童期的总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇水平与其母亲移植日的雌激素水平有明显的正相关性，其高胆固醇血症发生率显著增高。
　　第二部分：雌激素调控肝细胞脂代谢的机制研究。
　　目的：探讨雌激素对肝细胞合成总胆固醇和低密度脂蛋白的影响及其相关机制，明确雌激素在肝细胞脂代谢调控中的作用。
　　方法：体外实验以人肝癌细胞系HepG2为研究对象，通过不同浓度的雌激素和（或）同时加入雌激素受体阻断剂处理细胞，采用ELISA方法检测细胞上清的胆固醇含量，荧光定量PCR技术检测细胞中HMGCR，CYP7A1，LCAT, LPL的表达;利用染色质免疫共沉淀和荧光素酶活性测定检测HMGCR启动子区域的雌激素反应元件与雌激素受体的结合;高浓度雌激素处理原代小鼠胎肝细胞，荧光定量PCR技术检测细胞中HMGCR的表达。
　　结果：雌激素能够明显促进HepG2细胞总胆固醇和低密度脂蛋白的生成和上调HMGCR的表达，并且这种上调作用可被雌激素受体阻断剂完全阻断，但雌激素对CYP7A1，LCAT, LPL的表达无影响。HMGCR转录起始位点-3081/-3069bp处存在雌激素反应元件结构，在HepG2细胞中，雌激素可通过该雌激素反应元件调节HMGCR的表达。在原代胎鼠肝细胞中，高浓度雌激素能够显著上调的HMGCR的表达。
　　结论：高浓度雌激素可上调人肝细胞系和原代胎肝细胞的HMGCR的表达。雌激素通过作用于HMGCR转录起始位点-3081/-3069bp处的雌激素反应元件使HMGCR的表达升高，从而增加肝细胞胆固醇的生成，发挥调控脂代谢的作用。
　　第三部分：孕期高雌激素动物模型的建立及子代肝脏胆固醇合成限速酶HMGCR甲基化改变。
　　目的：研究宫内高雌坏境出生小鼠子代的生长发育和脂代谢状况，以及胆固醇合成通路上的限速酶HMGCR的差异甲基化区的甲基化改变，评估宫内高雌激素暴露子代小鼠发生高血脂的风险及其机制。
　　方法：通过促排卵技术建立孕期高雌激素小鼠模型，自然妊娠小鼠为对照组，监测孕鼠妊娠阶段的血清雌激素水平，检测对照组(Control)和宫内高雌激素组（Intrauterine high estrogen group，简写为HE）子代3周龄和8周龄的体重、肝脏比重;ELISA检测出生子代3周龄和8周龄的血清血脂水平。对12.5天的胎鼠、3周和8周的出生子代小鼠肝脏行实时定量PCR检测HMGCR的表达;采用亚硫酸氢盐测序的方法检测12.5天的胎鼠和3周龄子代小鼠肝脏HMGCR DMR的甲基化改变。
　　结果：通过促排卵技术可以建立孕期高雌激素小鼠模型。宫内高雌暴露的子代小鼠的体重在3周龄和8周龄无差异，而肝脏比重在3周龄明显高于对照组，8周龄无差异。子代小鼠幼儿期的血清总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、甘油三酯水平明显高于对照组，而高密度脂蛋白胆固醇水平二者无差异;到了成年期，子代小鼠的血脂水平与对照组差异缩小，但是低密度脂蛋白胆固醇仍显著高于自然妊娠组子代。宫内高雌暴露的子代小鼠在胎儿时期、3周龄时期的HMGCR的表达显著性升高，而其肝脏在这两个时期的HMGCR DMR的总体甲基化水平明显低于对照组。
　　结论：宫内高雌环境出生子代小鼠幼儿期和成人期出现血脂显著性增高的异常表型。其子代小鼠在胎儿期、幼儿期的HMGCR表达显著升高，而子代小鼠肝脏在胎儿时期和幼儿期的HMGCR差异甲基化区总体甲基化水平显著降低，是HMGCR表达升高的主要机制，进而导致机体胆固醇合成异常。
　　第四部分：宫内高雌激素暴露胎鼠肝脏长链非编码RNA表达谱分析及Gm5196调控胆固醇生成的机制研究。
　　目的：系统的了解生命早期高雌激素暴露对子代长链非编码RNA(lncRNA)表达谱的影响，筛选与子代高血脂表型相关的长链非编码RNA，验证其生物学功能并探讨相关分子机制。
　　方法：研究入选了宫内高雌激素组和正常妊娠组的妊娠12.5天的ICR胎鼠肝脏各五例，进行LncRNAs表达芯片分析。采用实时定量PCR方法在25例胎鼠肝脏组织中验证差异明显的8个lncRNA。利用生物信息学对芯片结果进行分析，筛选目标lncRNA Gm5196，并在HepG2上采用实时定量PCR方法验证雌激素处理后其表达的变化。应用siRNA特异性降低Gm5196的表达后，观察与其相关mRNA Osbpl5及HepG2细胞总固醇生成的变化。
　　结果：通过胎鼠肝脏长链非编码RNA表达谱分析，我们发现在宫内高雌暴露的胎儿肝脏组织中差异表达的lncRNAs的数目为633个，其中上调表达的lncRNAs数目为316个，下调表达的lncRNAs数目为317个。我们在胎肝中验证了8个差异显著的lncRNA，与芯片的结果一致，证实了芯片结果的可靠性。CNC网络图提示差异lncRNA Gm5196可能影响脂代谢。HepG2细胞实验显示雌激素可以下调Gm5196并上调Osbpl5的表达，干扰Gm5196可以上调Osbpl5的表达并促进总胆固醇的生成。
　　结论：宫内高雌激素暴露的环境会导致胎鼠肝脏lncRNAs表达谱的改变。雌激素能够降调lncRNA Gm5196的表达，同时上调Gm5196相关mRNA Osbpl5的表达。干扰lncRNA Gm5196后会增加肝细胞Osbpl5的表达以及胆固醇生成。LncRNAGm5196可能参与了宫内高雌坏境暴露致子代高血脂倾向的表观遗传学调控。

目录

声明

致谢

序言

摘要

缩略词表

第一部分 妊娠早期高雌激素暴露子代的生长发育和脂代谢追踪研究

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

参考文献

第二部分 雌激素调控肝细胞脂代谢的机制研究

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

参考文献

第三部分 孕期高雌激素动物模型的建立及子代肝脏胆固醇合成限速酶HMGCR甲基化改变

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

第四部分 宫内高雌激素暴露胎鼠肝脏长链非编码RNA表达谱分析及Gm5196调控胆固醇生成的机制研究

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

综述 孕期不良暴露与成年期疾病

作者简介及在读期间科研成果