法尼基焦磷酸合成酶在血管紧张素Ⅱ诱导心肌纤维化中的研究

摘要

第一部分抑制法尼基焦磷酸合成酶改善血管紧张素Ⅱ诱导的心肌纤维化
　　研究背景:
　　心肌成纤维细胞是心脏中的主要细胞，在心肌纤维化的过程中发挥重要作用。许多体液刺激因子可诱导心肌纤维化，例如血管紧张素Ⅱ、内皮素1等。多种细胞信号转导通路参与了血管紧张素Ⅱ诱导的心肌纤维化，如RhoA通路。
　　以往的研究表明双膦酸盐，如阿伦磷酸钠、唑来磷酸钠等，可抑制甲羟戊酸途径中的一种关键酶—法尼基焦磷酸合成酶，从而抑制法尼基化和牻牛儿基牻牛儿基化，进而减少异戊二烯的合成，而牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸对于RhoA的牛儿基牻牛儿基化和活化非常重要。
　　目的:
　　本实验主要研究唑来磷酸钠是否可通过抑制法尼基焦磷酸合成酶进而抑制血管紧张素Ⅱ诱导的心肌纤维化，同时研究该作用是否与RhoA通路相关。
　　方法:
　　(1)、在心肌成纤维细胞中加入10-30μM唑来磷酸钠作用30分钟，然后加入0.1μM血管紧张素Ⅱ作用48小时，加药前细胞在无血清培养基中孵育24小时，检测心肌纤维化指标如Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、转化生长因子β1以及法尼基焦磷酸合成酶蛋白水平的改变。
　　(2)、在心肌成纤维细胞中加入10μM唑来磷酸钠以及相同浓度的FOH或者GGOH作用30分钟，然后加入0.1μM血管紧张素Ⅱ作用48小时，加药前细胞在无血清培养基中孵育24小时，检测心肌纤维化指标如Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、转化生长因子β1以及法尼基焦磷酸合成酶蛋白和RNA水平的改变。
　　(3)、在心肌成纤维细胞中加入10μM唑来磷酸钠以及相同浓度的GGOH作用48小时，然后加入1μM血管紧张素Ⅱ作用15分钟，加药前细胞在无血清培养基中孵育24小时，使用pull-down试剂盒和western blot技术检测活性和总RhoA的改变。
　　(4)、在心肌成纤维细胞中加入50μM siRhoA或control siRNA作用24小时，然后在无血清培养基中孵育24小时后加入0.1μM血管紧张素Ⅱ作用48小时，检测心肌纤维化指标如Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、转化生长因子β1以及法尼基焦磷酸合成酶蛋白和RNA水平的改变。
　　结果:
　　(1)、唑来磷酸钠作为法尼基焦磷酸合成酶抑制剂可剂量依赖性抑制血管紧张素Ⅱ诱导的心肌纤维化指标如Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、转化生长因子β1以及法尼基焦磷酸合成酶蛋白水平的表达。
　　(2)、GGOH部分逆转了唑来磷酸钠的抗心肌纤维化反应。
　　(3)、血管紧张素Ⅱ诱导的心肌纤维化反应与RhoA活化相关。
　　(4)、siRhoA抑制了血管紧张素Ⅱ诱导的心肌纤维化指标如Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、转化生长因子β1以及法尼基焦磷酸合成酶蛋白和RNA水平的表达。
　　结论:
　　本研究实验结果表明唑来磷酸钠通过抑制法尼基焦磷酸合成酶可有效逆转血管紧张素Ⅱ诱导的心肌纤维化，这种结果与抑制RhoA的活化和牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸化相关。同时，抑制RhoA的活性可抑制血管紧张素Ⅱ诱导的心肌纤维化和法尼基焦磷酸合成酶的表达。
　　第二部分 RNA干扰技术沉默法尼基焦磷酸合成酶改善血管紧张素Ⅱ诱导的心肌纤维化
　　研究背景:
　　第一部分实验结果表明抑制法尼基焦磷酸合成酶可以逆转血管紧张素Ⅱ诱导的心肌纤维化，提示法尼基焦磷酸合成酶可能是血管紧张素Ⅱ介导心肌纤维化的重要靶点。以往的实验证明，在体内和体外水平的心肌肥厚模型中，法尼基焦磷酸合成酶的表达明显升高，同时，在血管紧张素Ⅱ介导的心肌纤维化模型中，RhoA活性表达明显上升。上述证据表明法尼基焦磷酸合成酶可能在血管紧张素Ⅱ介导的心肌纤维化模型中的重要性，以及可能与RhoA激活相关。本实验探索法尼基焦磷酸合成酶是否在血管紧张素Ⅱ介导的心肌纤维化反应中上调，同时在此基础上通过RNA干扰技术沉默法尼基焦磷酸合成酶，观察是否影响心肌纤维化的形成，探索法尼基焦磷酸合成酶下游RhoA活性的变化。
　　目的:
　　本实验探索法尼基焦磷酸合成酶是否在血管紧张素Ⅱ介导的心肌纤维化反应中上调，同时在此基础上通过RNA干扰技术沉默法尼基焦磷酸合成酶，观察是否影响心肌纤维化的形成，探索法尼基焦磷酸合成酶下游RhoA活性的变化。
　　方法:
　　(1)、使用western blot和real-time PCR技术检测血管紧张素Ⅱ介导的体内和心肌纤维化模型中法尼基焦磷酸合成酶转录和翻译水平的改变。
　　(2)、选择法尼基焦磷酸合成酶重组慢病毒转染乳鼠心肌成纤维细胞，观察法尼基焦磷酸合成酶下调是否影响心肌纤维化指标如Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、转化生长因子β1的改变。
　　(3)、进一步在细胞水平研究法尼基焦磷酸合成酶沉默后下游RhoA的改变，使用pull-down试剂盒和western blot技术检测活性RhoA和总RhoA的改变。
　　结果:
　　(1)、血管紧张素Ⅱ在诱导心肌纤维化形成的同时也引起法尼基焦磷酸合成酶的上调，同时在8周龄大鼠血管紧张素Ⅱ诱导的纤维化心脏中法尼基焦磷酸合成酶的转录和翻译水平也上调。
　　(2)、法尼基焦磷酸合成酶重组慢病毒转染乳鼠心肌成纤维细胞可明显抑制血管紧张素Ⅱ诱导的心肌纤维化指标如Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、转化生长因子β1的表达。
　　(3)、法尼基焦磷酸合成酶重组慢病毒有效抑制血管紧张素Ⅱ诱导的RhoA活性。
　　结论:
　　法尼基焦磷酸合成酶表达在血管紧张素Ⅱ介导的心肌纤维化模型中上调，揭示了法尼基焦磷酸合成酶在心肌纤维化中的重要性。同时，法尼基焦磷酸合成酶调控的RhoA活性在血管紧张素Ⅱ介导的心肌纤维化扮演重要作用。