含铜介孔生物玻璃/多孔羟基磷灰石复合支架的制备及其义眼座应用的基础研究

摘要

第一部分湿化学法合成羟基磷灰石粉体及制备多孔羟基磷灰石支架
　　目的：
　　目前临床常用的羟基磷灰石(HA)义眼座主要来源于珊瑚。以珊瑚水热相转化羟基磷灰石(CHA)所得的多孔眼座微孔道和生物活性均受原料珊瑚微结构和相转化工艺的限制，无法达到治疗最佳效果，且因来源限制，价格昂贵。虽然已有人工合成的HA义眼座，但仍无法完全满足临床需求，本研究拟以多孔HA为基体，在此基础上进行修饰，研制新型义眼座。
　　方法：
　　本实验以硝酸钙(Ca(NO3)2·4H2O)，磷酸氢二铵((NH4)2HPO4)为原料，采用湿化学沉淀法制备羟基磷灰石粉体。用X射线衍射(XRD)对所制备HA的物相进行分析，粒度分析仪分析HA粉体粒度分布。利用粉末压片机制备HA致密陶瓷片，并通过体外细胞培养，MTT比色法计算细胞相对增殖率，按照国家标准GB/T1688615-1997“医疗器械生物学评价第五部分:细胞毒性试验体外法”进行HA生物相容性评价。用扫描电镜观察细胞在HA陶瓷片上的形态。最后，采用石蜡微球法制备多孔HA支架材料，并用排乙醇法、扫描电镜等分析手段对其形貌和性能进行检测。
　　结果：
　　利用湿化学沉淀法制备羟基磷灰石粉体，XRD图谱证实所制备的HA为单一相，无杂相，结晶度良好。粒度分析显示该HA粉体平均粒径577.4nm，粒径分布集中，符合之后制备致密及多孔HA陶瓷的需求。MTT结果显示人脐静脉内皮细胞在致密HA陶瓷片上生长增殖良好，结合扫描电镜结果证实合成所得的HA具有良好的生物相容性。采用石蜡微球法制备的多孔HA支架，材料表面疏松多孔，孔径分布在200～500um，孔隙率约75％。
　　结论：
　　控制钙磷比为1.67，利用湿化学沉淀法成功制备羟基磷灰石粉体，制备的HA陶瓷片具有良好的生物相容性。采用石蜡微球法制备的多孔HA支架，材料疏松多孔，孔隙率较高。可作为人工合成HA义眼座材料。为进一步研制新型复合材料义眼座提供基础。
　　第二部分含铜介孔生物玻璃的制备及其相关性能初步研究
　　目的：
　　目前临床上预防义眼座植入相关感染主要是围手术期全身抗生素使用和植入前义眼座浸泡抗生素溶液，但浸泡不能将抗生素有效地带入多孔义眼座内部。另外，眼座暴露后感染风险增大，抗生素不能有效到达多孔义眼座内部，使感染难以控制。本研究通过合成介孔生物玻璃(MBG)并明确其微结构特征，在此基础上进行不同剂量的铜掺杂，进而研究不同铜掺杂比例对介孔结构的影响，以期寻找一种合适的材料，用以改善HA义眼座性能，为新型义眼座材料的设计和研制方案提供实验基础。
　　方法：
　　以非离子嵌段共聚物P123为模板剂，以TEOS、TEP、四水硝酸钙为无机前驱体，采用溶胶-凝胶法(sol-gel)并结合溶剂挥发诱导自组装技术(EISA)制备MBG材料。通过改变无机前驱体的投入比，获得不同掺铜比例的含铜介孔生物玻璃(xCu-MBG; x=0，2，5)。采用场发射扫描电镜(FE-SEM)观察xCu-MBG粉体微观形貌，面扫描能谱分析其成分组成。采用透射电镜(TEM)和氮气等温吸脱附实验检测介孔参数（比表面积，介孔孔容、孔径分布）。采用材料浸提液-大鼠骨髓干细胞(rBMSC)培养法，分析合成所得MBG材料的生物相容性。
　　结果：
　　采用sol-gel-EISA技术成功制备了介孔生物玻璃。结合海绵浸渍法可得到疏松的多孔支架。xCu-MBG(x=0，2，5)粉体在SEM下形态无明显差别，面扫描能谱(EDX)分析显示所得粉体组份随着无机前驱物的投入比改变而改变，从而获得不同掺铜量的MBG。TEM观察发现xCu-MBG均具有排列规则有序的二维柱状介孔结构。氮气等温吸脱附曲线符合Ⅳ型吸附等温线并有H2型滞后环（根据IUPAC国际纯粹化学与应用化学联合会规定）;进一步数据分析，0Cu-MBG的介孔的表面积、孔容积及孔径大小分别为413 m2/g，0.46 cm3/g和4.8nm。随着铜掺杂量的增加，以上参数均呈下降趋势。采用材料浸提液-大鼠骨髓间充质干细胞细胞培养法，MTT比色法显示所制备的材料无明显细胞毒性。
　　结论：
　　本研究通过sol-gel-EISA技术成功制备了介孔生物玻璃。采用TEM和氮气等温吸脱附曲线对其进行表征，表明制备的MBG具有介孔结构且孔道均匀，孔径大小为3～6nm。随着掺铜量的增加，介孔孔径和比表面积呈下降趋势。通过细胞毒性实验，证实了本研究制得的xCu-MBG无明显细胞毒性。xCu-MBG高比表面积和规则有序的介孔结构，具有作为载药缓释系统的潜能，将其引入义眼座材料，有希望研制一种具载药和缓释功能的新型义眼座。
　　第三部分 xCu-MBG/pHA复合支架制备及其性能初步研究
　　目的：
　　多孔义眼座植入以弥补眶内容物缺失联合义眼片配戴，是修复眼球缺失、恢复面部外观较为理想的治疗方案。然而目前临床使用的眼座仍存在植入物暴露、感染等问题。本研究拟采用剂蒸发诱导自组装(EISA)-高温烧结的方法将Cu-MBG修饰于多孔HA孔道壁，以此构建Cu-MBG/pHA复合材料，探讨Cu-MBG/pHA复合材料的载药能力和药物释放规律，以及Cu-MBG/pHA的抗菌性能，为新型多性能义眼座的研究奠定基础，同时也为临床上多种缓释材料、支架的制备提供一种新的方法和研究思路。
　　方法：
　　制备xCu-MBG溶胶-凝胶(x=0，2，5)，通过浸渍将xCu-MBG前驱体涂布到多孔HA支架的孔道壁上;真空抽吸去除孔道内富余凝胶。高温烧结使得xCu-MBG与HA贴合，从而制备xCu-MBG/pHA复合材料。选用氧氟沙星作为模型药物研究x Cu-MBG涂层对pHA支架载药量的影响。通过用紫外-分光光度法（波长293nm处）检测载药前后氧氟沙星-PBS溶液中药物的浓度改变计算xCu-MBG/pHA的载药量。采用《中国药典》小杯法，不同时间点取样后用紫外-分光光度法检测氧氟沙星浓度，计算累计释放率，对xCu-MBG/pHA复合材料的药物缓释性能进行研究。采用牛津杯法研究xCu-MBG/pHA的抗菌性能。
　　结果：
　　利用EISA-高温烧结法将薄层xCu-MBG复合到多孔HA支架的孔道壁上。复合后多孔支架孔隙率轻微下降。制备的xCu-MBG/pHA复合材料具有高效的药物负载能力，0Cu-MBG/HA载药率最高，可达60％，随着铜离子掺杂增加，载药量下降，但相较于单纯的HA（载药率只有14.4％），仍显示出载药优势，差异具有统计学意义。药物缓释结果显示xCu-MBG/pHA均具有良好的药物缓释性能，能长时间释放药物，缓释168小时后释放率仍保持在40％以下，将抗生素“固定”在植入物局部，对提高植入物抗菌能力具有重大意义。采用牛津杯法研究xCu-MBG/pHA的抗菌性能，发现MBG/pHA无抗菌能力，随着铜掺杂量的增加，Cu-MBG/pHA抗菌性能随之增加。
　　结论：
　　本研究首次应用EISA-高温烧结法成功制备xCu-MBG/pHA复合支架，在保证大孔孔隙率的同时引入介孔生物玻璃，使得多孔支架获得高效载药能力和药物缓释性能。此外，通过铜掺杂MBG，可赋予Cu-MBG/pHA抗菌性能。为新型多性能义眼座的研制和开发奠定了实验与技术基础。