运用镧系金属探针的顺磁及发光特性研究蛋白质相互作用

摘要

研究背景:
　　镧系金属属于稀土元素，其中的钆具有良好的顺磁特性，而铽具有良好的发光特性。在生物医学研究领域中，镧系金属探针的顺磁及发光特性通过溶液核磁共振及荧光波谱学技术，可以被用来标记蛋白质，并进行蛋白质相互作用的研究。
　　大肠杆菌的磷酸转移酶系统(phosphotransferase system，PTS)中存在着较为复杂的磷酸化反应网络，其中一条经典信号通路是磷酸基团由磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)依次经过酶EⅠ、HPr，最后传递给酶EⅡA。酶EⅡA与特定糖类吸收相关，例如EⅡAGlc，EⅡAMtl和EⅡAMan分别对应葡萄糖，甘露醇和甘露糖的吸收。而磷酸基团传递是依靠相互作用的蛋白质复合体完成的，并且其中很多都是相互作用很弱的瞬时遭遇复合体（transient encounter complex）。利用核磁共振(NMR)中的顺磁弛豫增强（Paramagnetic relaxation enhancement，PRE）技术，可以检测到这些弱相互作用和低丰度复合体的存在。基于细胞信号传导网络化特征和STRING数据库推测，PTS中EⅠ和EⅡA之间可能存在相互作用。因此，采用基于钆的顺磁探针，利用PRE NMR技术对EⅠ和EⅡA间可能的相互作用进行研究将是比较适宜的。
　　与PRE技术相类似，荧光技术同样应用十分广泛，特别是在活细胞等在体实验中，可以进行实时特异性的观测。但是荧光标记的特异性、有效性、稳定性以及生物样本自发荧光等问题都比较难解决。铽具有良好的发光特性，其发射谱位于可见光区，并且其荧光寿命达毫秒级，可以通过时间延迟检测，扣除寿命只有纳秒量级的背景荧光。因此，利用镧系金属结合标签(Lanthanide binding tag，LBT)结合铽，并以此作为发光探针对蛋白质进行特异性的标记，则可以很好地弥补荧光技术的不足。
　　半胱氨酰白三烯受体(cysteinyl leukotriene receptor，CysLTR)属于G蛋白偶联受体，包含CysLT1R和CysLT2R两种亚型。在中枢神经系统，CysLTR与脑缺血损伤病理过程密切相关。但是，限于现有的技术手段，对CysLTR的研究还不是很深入，CysLTR的结构、寡聚状态、动态运动和配体识别机制等问题都亟待研究解决，而首要的任务就是对CysLTR进行合适的标记。
　　研究目的:
　　采用基于钆的顺磁探针，利用PRE NMR技术对EⅠ和EⅡA间的相互作用进行研究，以验证大肠杆菌PTS中一条非经典通路的存在;通过LBT结合铽作为发光探针对人半胱氨酰白三烯受体(hCysLTR)进行标记，并实现在活细胞中的观察。
　　研究方法及结果:
　　第一部分利用钆的顺磁特性研究大肠杆菌磷酸转移酶系统的非经典通路
　　通过EⅠN（EⅠ的N端结构域）和EⅡAmtl之间的NMR滴定实验，以及分别向EⅡAMtl E69C突变体、EⅡAGlc E97C和D144C突变体引入Gd3+-EDTA-benzyl-acetate顺磁探针后与EⅠN间的PRENMR实验，我们发现了EⅠ和EⅡA之间存在着极弱的相互作用，其平衡解离常数Kd约为13mM，并且确定了可能的相互作用界面。
　　通过体外NMR实验测定磷酸化酶促反应，我们发现EⅡAGlc，EⅡAMtl和EⅡAMan都是可以被EⅠ直接磷酸化的。并且，HPr-H15A酶活缺失突变体对EⅡA被EⅠ直接磷酸化的过程有抑制效应。这提示EⅡA被EⅠ磷酸化的过程可以没有HPr的参与。
　　最后，通过测定△ptsH以及△ptsH-H15A菌株在单一碳源极限培养基中的生长曲线和糖源消耗曲线，我们发现在细菌体内，EⅡA也是可以被EⅠ直接磷酸化的。这说明EⅠ和EⅡA间的相互作用是具有生理意义的。
　　第二部分利用铽的发光特性在活细胞中标记人半胱氨酰白三烯受体2
　　通过分子生物学方法在hCysLTlR和hCysLTR蛋白N末端及细胞膜外三个loop环区设计位点，分别插入LBT，并瞬时转染至HEK-293细胞，表达含有LBT突变的hCysLTR蛋白。
　　利用hCysLTR的激动剂白三烯D4(LTD4)刺激转染细胞，通过Fluo-4测定细胞内钙增高来判断受体功能是否受到突变的影响。结果发现，将含LBT的质粒转染HEK-293细胞后，与转染野生型受体相比，N末端连接LBT后，LTD4刺激不能引起细胞内钙增高，而分别在胞外不同loop区插入的LBT，则对LTD4引起的细胞内钙增高无显著影响。
　　通过光学显微镜成像和MTT法检测，发现浓度为0.1 nM-1μM的Tb3+对HEK-293细胞的形态及活性无明显影响。
　　以上实验结果说明LBT结合Tb3+作为发光探针，可以进一步用于hCysLTR的膜外loop区的标记检测实验。
　　最后，我们通过多功能酶标仪和多光子显微镜在活的HEK-293细胞中观察到了Tb3+对hCysLTR的标记。
　　结论:
　　借助钆的顺磁特性，通过PRE NMR实验，我们发现了EⅠ和EⅡA之间具有极弱的相互作用，并且能够直接传递磷酸基团，因此证明了大肠杆菌PTS中由EⅠ直接到EⅡA的非经典信号通路的存在。
　　利用铽的发光特性，我们实现了在活HEK-293细胞中对hCysLTR的标记。这为今后对半胱氨酰白三烯受体的结构和功能研究打下了基础。