无细胞体系高效合成复杂膜蛋白的关键技术及工业应用探索

摘要

膜蛋白由于具有极其重要的生物学和医学意义，其研究已经成为蛋白质科学、结构生物学以及医学药学领域的重要部分，同时也是仿生膜等工程领域的研究基础。膜蛋白有不同的分类方法，既包括一次跨膜结构的简单膜蛋白，又包括多次跨膜的复杂膜蛋白。复杂膜蛋白包括受体蛋白，离子通道蛋白，转运蛋白，催化膜上反应的酶等具有各种生物学功能的蛋白质，其结构和功能研究关系着生命科学的各个方面。然而，膜蛋白尤其是复杂膜蛋白的大量制备仍然是现有体内蛋白表达技术难以攻克的难关之一。无细胞蛋白合成体系则为体内难以表达的膜蛋白研究提供了崭新的思路。
　　本文选取线虫嗅觉受体ODR-10为目标开展了G蛋白偶联受体(GPCR)在无细胞系统高效表达的研究。GPCR是膜蛋白的一个重要组成部分，是许多药物筛选的靶点。本文采取了添加去污剂和脂质体两种策略在大肠杆菌无细胞体系实现ODR-10蛋白的可溶表达，可溶性ODR-10的表达水平达到100μg/mL以上。添加脂质体的策略促进了受体蛋白更加正确的折叠，同时可以使嗅觉受体在原位被合成、折叠和重构，这将方便嗅觉受体蛋白的结构和功能研究，为嗅觉传感器的制备提供支持。
　　在实现受体蛋白大量可溶表达的基础上，本文进一步研究了通道蛋白的大量制备。选取了大肠杆菌水通道蛋白AqpZ为目标蛋白，利用大肠杆菌无细胞体系高效表达，并采取Ni2+亲和层析纯化得到目标蛋白。纯化后的AqpZ成功嵌入到脂质体上，并证实了功能活性。采用信号肽策略使AqpZ在无细胞体系的表达水平进一步提高。通过在无细胞体系中添加一定浓度的去污剂或脂质体可以原位切除信号肽，简化了纯化步骤，得到了天然大小的具有功能活性的AqpZ。该策略使得在一个反应器中能同时完成转录翻译、信号肽切除、膜蛋白正确折叠的过程。
　　膜蛋白有许多有前景的工业应用，例如各种仿生膜的制备。在得到大量AqpZ的前提下，选取AqpZ进行了水通道过滤芯片的制备探索。本文制备了纳米氧化铝支撑的双分子膜，并合成了两亲性双嵌段聚合物PMOXA-PDMS-PMOXA，研究了其与AqpZ的相互作用。结果证明聚合物更适于制备稳定的固体支撑膜，用于海水淡化或者废水回收。
　　许多膜蛋白都具有糖链，大部分有医学应用前景的蛋白质也都是糖蛋白。如何实现糖蛋白的高效异源表达也是膜蛋白大量制备需要解决的问题。本文探索了酵母无细胞蛋白合成体系的制备，发明了一种简便易行的酵母无细胞表达体系。该体系细胞容易培养，成本廉价，制备工艺简单，与其他真核体系相比具有一定优势。通过代谢改造可能会使酵母无细胞系统表达的异源糖蛋白更接近药物蛋白的要求。
　　总之，本文致力研究膜蛋白在无细胞蛋白合成体系的高效表达策略以及应用研究，并为试图构建新的无细胞蛋白合成体系以适于各种膜蛋白表达。

目录

声明

致谢

摘要

第一章 绪论

1．1 引言

1．2 膜蛋白

1．2．1 膜蛋白介绍

1．2．2 膜蛋白的分类

1．2．3 膜蛋白的研究现状

1．3 无细胞蛋白合成体系

1．3．1 无细胞蛋白合成体系简介

1．3．2 无细胞蛋白合成体系的优势

1．3．3 常用的无细胞蛋白合成体系

1．3．4 无细胞蛋白合成体系研究进展

1．3．5 无细胞蛋白合成体系的应用前景

1．3．6 无细胞系统合成膜蛋白的优势

1．3．7 无细胞系统合成膜蛋白的策略

1．4 嗅觉受体蛋白

1．4．1 嗅觉受体蛋白介绍

1．4．2 嗅觉受体异源表达

1．4．3 嗅觉受体蛋白的应用研究

1．5 水通道蛋白

1．5．1 水通道蛋白介绍

1．5．2 大肠杆菌水通道蛋AqpZ

1．5．3 目前水通道蛋白的表达情况

1．5．4 AqpZ的应用研究

1．6 无细胞体系合成异源糖蛋白的研究

1．6．1 糖蛋白简介及常用表达系统

1．6．2 无细胞体系合成异源糖蛋白的研究进展

1．7 本工作的研究思路及拟研究内容

第二章 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 实验菌株

2．1．2 质粒

2．1．3 重要试剂、工具酶及试剂盒

2．1．4 培养基

2．2 实验仪器

2．3 实验及分析方法

2．3．1 分子克隆实验

2．3．2 DNA分子摩尔浓度测定

2．3．3 细胞密度的测定

2．3．4 SDS-PAGE电泳

2．3．5 Western-blot分析

2．3．6 大肠杆菌无细胞反应体系

2．3．7 脂质体的制备

第三章 大肠杆菌无细胞体系高效表达嗅觉受体蛋白ODR-10

3．1 引言

3．2 材料与方法

3．2．1 表达载体的构建

3．2．2 无细胞体系表达ODR-10

3．2．3 两种策略提高ODR-10可溶表达

3．2．4 无细胞体系添加去污剂可溶表达ODR-10

3．2．5 无细胞体系添加脂质体可溶表达ODR-10

3．2．6 SDS-PAGE和Western-blot

3．3 结果与讨论

3．3．1 表达载体的构建

3．3．2 无细胞体系表达ODR-10

3．3．3 筛选去污剂提高ODR-10的可溶表达水平

3．3．4 去污剂浓度对ODR-10可溶表达的影响

3．3．5 无细胞体系添加脂质体提高ODR-10可溶表达

3．3．6 添加去污剂和脂质体两种策略表达ODR-10的比较

3．4 本章小结

第四章 大肠杆菌无细胞体系高效表达水通道蛋白AqpZ

4．1 引言

4．2 材料与方法

4．2．1 无细胞表达载体pIVEX2．4c-AqpZ-His的构建

4．2．2 AqpZ的纯化

4．2．3 AqpZ蛋白浓度测定

4．2．4 DOPC脂质体的制备

4．2．5 AqpZ脂蛋白体的制备

4．2．6 AqpZ功能检测

4．2．7 信号献融合表达载体的构建

4．2．8 无细胞体系表达含信号肽的AqpZ

4．2．9 信号肽策略表达的AqpZ功能检测

4．3 结果与讨论

4．3．1 plVEX2．4c-AqpZ-His表达载体的构建

4．3．2 AqpZ表达q纯化

4．3．3 AqpZ脂蛋白体的制备

4．3．4 AqpZ功能的检测

4．3．5 信号肽融合载体的构建

4．3．6 信号肽融合提高AqpZ的表达水平

4．3．7 添加去污剂或脂质体原位切除信号肽

4．3．8 信号肽融合表达的AqpZ功能测定

4．4 小结

第五章 水通道蛋白过滤芯片制备的初步探索

5．1 引言

5．2 材料与方法

5．2．1 实验材料

5．2．2 AAO模板镀金

5．2．3 AAO支撑的磷脂双分子层制备

5．2．4 原子力显微镜(AFM)检测

5．2．5 电化学阻抗分析

5．2．6 两亲性嵌段共聚物PMOXA-PDMS-PMOXA合成

5．2．7 Langmuir-Blodgett单分子层制备

5．2．8 LB法考察AqpZ嵌入磷脂或聚合物的能力

5．2．9 不同离子对AqpZ嵌膜的影响

5．3 结果与讨论

5．3．1 AAO模板镀金处理

5．3．2 AAO支撑的磷脂双分子层AFM检测

5．3．3 AAO支撑的磷脂双分子层阻抗分析

5．3．4 PMOXA-PDMS-PMOXA制备

5．3．5 PMOXA-PDMS-PMOXA成膜表征

5．3．6 AqpZ嵌入磷脂或聚合物能力的考察

5．3．7 离子对AqpZ嵌入单分子层情况的影响

5．4 本章小结

第六章 酵母无细胞蛋白合成体系构建

6．1 引言

6．2 材料与方法

6．2．1 实验材料

6．2．2 质粒构建

6．2．3 酵母生长曲线测定

6．2．4 缓冲液制备

6．2．5 酵母抽提物制备

6．2．6 酵母无细胞体系构建

6．2．7 T7 RNA聚合酶制备

6．2．8 载体pSITS-eGFP的通用性考察

6．2．9 绿色荧光蛋白荧光活性测定

6．2．10 核糖核酸酶处理抽提物

6．2．11 线性模板制备

6．3 结果与讨论

6．3．1 质粒构建

6．3．2 大肠杆菌、昆虫以及酵母无细胞体系中pSITS-eGFP的最达

6．3．3 酵母菌无细胞抽提物制备条件的探索

6．3．4 无细胞反压条件的优化

6．3．5 线性模板的可行性

6．4 本章小结

第七章 结论与展望

7．1 结论

7．2 展望

参考文献

作者简历