拟南芥WRKY转录因子在非生物胁迫响应中的功能研究

摘要

干旱、盐胁迫和酸性土壤中的铝毒害是造成作物减产的主要非生物逆境，而植物响应这些胁迫的信号转导以及分子调控机制仍有待进一步的研究和拓展。转录因子在植物信号调控网络中发挥了极其重要的作用，它们一方面接受被感知的信号进而调控下游基因的表达，另一方面又能成为一个节点，协调不同信号途径之间的相互作用。因此，对转录因子逆境响应的功能研究是我们从分子水平上认识植物如何适应恶劣环境的重要基础。WRKY家族是植物最大的转录因子家族之一，其调控范围涵盖植物生长发育和逆境响应等多种生理活动。尽管WRKY蛋白在生物胁迫反应中已得到了广泛的研究，但其在非生物胁迫应答中的研究还处于起步阶段。本文对拟南芥(Arabidopsis thaliana)中的33个WRKY基因进行表达分析，最终筛选到了2个WRKY（WRKY46和WRKY41）参与快速响应过氧化氢和镉的处理，随后对这2个基因的功能进行了系统的研究。主要结果分为以下四个方面:
　　1、WRKY46调控渗透胁迫响应以及光依赖的气孔运动
　　在多种非生物胁迫的处理中，WRKY46对水分胁迫（干旱、渗透和盐胁迫）的响应尤为明显。干旱和盐胁迫在短时间内便可显著提高WRKY46的转录水平和蛋白水平。WRKY46 T-DNA插入突变体对干旱和盐胁迫十分敏感，表现为突变体地上部生长差于野生型。然而，WRKY46过表达株系在平板处理条件下（封闭的环境）对盐和渗透胁迫有较高的耐性，但在土培条件下（开阔的环境）却对干旱和盐胁迫非常敏感。原因是WRKY46过表达植株的叶片具有较高的失水率。进一步研究发现，WRKY46的过表达可以抑制保卫细胞中ROS(reactive oxygenspecies)的产生，从而破坏ABA(abscisic acid)诱导的气孔关闭过程。另一方面，我们发现WRKY46受光的诱导表达，并且其在保卫细胞中的表达不受干旱等处理的影响。WRKY46在保卫细胞中的主要作用可能是参与光依赖的气孔打开过程。基因芯片分析发现，WRKY46调控了一系列参与细胞渗透保护和氧化还原平衡的基因的表达。此外，WRKY46也通过调控QQS(QUA-QUINESTARCH)基因的表达来调控保卫细胞中的淀粉代谢，从而调节气孔的打开过程。
　　因此，WRKY46在胁迫应答和气孔调控中发挥了两种独立的作用:一是调控干旱和盐胁迫下植物细胞的渗透保护和降低氧化胁迫;二是通过调控保卫细胞中淀粉的代谢来调节气孔的打开。
　　2、WRKY46调控盐和渗透胁迫下的侧根发育
　　组织定位分析表明，WRKY46在侧根发育初期的根原基以及成熟侧根的中柱中表达。WRKY46的功能缺失导致植株在盐和渗透胁迫下的侧根发育受到明显的抑制（相对于野生型）。相反，WRKY46的过表达能够增强植株在胁迫下的侧根发育。外源添加生长素可以极大地回复wrky46突变体在胁迫下的侧根表型，而生长素极性运输抑制剂(TIBA)同时抑制野生型和WRKY46过表达植株在胁迫下的侧根发育，说明WRKY46对侧根的调控依赖生长素。对WRKY46的表达模式分析发现，WRKY46在根中的表达受到ABA的显著抑制，但同时在盐或渗透胁迫下，WRKY46也受到ABA以外的信号调控。DR5(∶)GUS在wrky46突变体中的表达明显低于在野生型中的表达。与此吻合的是，突变体根中游离IAA的含量出现降低，而桥连IAA的含量有所提高（相对于野生型）;而WRKY46过表达株系的IAA含量变化与突变体正好相反。基因表达分析发现，WRKY46在盐或渗透胁迫下调控ABI4(ABAINSENSITIVE4)和参与生长素桥连的相关基因的表达。染色质免疫共沉淀进一步证实WRKY46可以直接结合到这些基因的启动子上。以上结果证明，WRKY46通过调控ABA信号途径和生长素内稳态进而参与前馈抑制盐或渗透胁迫对植物侧根的抑制。
　　3、WRKY46调控铝诱导的苹果酸分泌
　　ALMT1编码苹果酸转运蛋白，是拟南芥一关键耐铝基因。我们发现在基因芯片中，ALMT1的表达明显受到WRKY46的抑制。在铝处理条件下，WRKY46的表达在处理3小时后出现显著的下调，而ALMT1的表达受铝处理的诱导。而且在组织表达上，WRKY46和ALMT1在拟南芥根中存在共同的表达区域，即两者均在根的中柱表达，说明两者可能存在调控关系。表型分析发现，wrky46突变体在铝处理下表现出较高的铝耐性（相对于野生型），并且突变体含有较低的根系铝含量。进一步分析发现，ALMT1在wrky46突变体中的表达明显提高，从而增强突变体根系苹果酸的分泌，缓解铝毒。烟草中的瞬时表达实验表明，WRKY46可以抑制ALMT1的表达。利用酵母单杂和染色质免疫共沉淀技术进一步证实，WRKY46可以直接结合到ALMT1启动子中的W-box上。以上结果证明，WRKY46是关键耐铝基因ALMT1的负调控因子，WRKY46的功能缺失提高根系苹果的分泌，从而降低根系的铝含量，提高植株对铝的耐性。
　　4、WRKY41调控种子休眠
　　尽管WRKY41也能快速响应过氧化氢和盐胁迫的诱导，但WRKY41的功能缺失突变体wrky41对这些处理的响应与野生型无明显差异。研究发现，WRKY41主要在种子中表达。WRKY41的功能缺失导致种子的初生休眠和热胁迫下产生的次生休眠都显著降低，并且wrky41的种子萌发和幼苗生长对ABA不敏感。而这种表型与ABI3(ABA INSENSITIVE3)的功能缺失十分相似。基因表达分析发现，WRKY41的缺失明显降低ABI3在种子发育以及萌发过程中的表达，而过表达WRKY41可以提高ABI3的表达。而且，在wrky41中过表达ABI3可以完全回复突变体种子休眠相关的表型。凝胶阻滞和染色质免疫共沉淀实验证明，WRKY41可以直接结合到AB13启动子的3个W-box上。同时转录激活实验表明这些W-box对AB13的表达十分重要。此外，WRKY41不在ABA的下游，并且WRKY41对ABI3的调控不依赖于ABA和其它ABI3的转录调控因子。但高浓度的ABA可以反馈抑制WRKY41的表达。最后，对wrky41 aba2双突变的分析表明，WRKY41和ABA共同调控ABI3的表达，进而调控种子休眠。

目录

论文说明

声明

致谢

摘要

缩略语表

图表目录

第1章 文献综述

1．1 植物转录因子概述

1．2 WRKY转录因子

1．2．1 WRKY转录因子的结构、分类及结合位点

1．2．2 WRKY家族的起源与进化

1．2．3 WRKY基因的生物学功能

1．3 ROS

1．3．1 ROS的产生

1．3．2 ROS的毒害作用

1．3．3 ROS的清除机制

1．3．4 ROS的生物学功能

1．4 问题的提出、拟解决的问题以及技术路线

1．4．1 问题的提出和拟解决的问题

1．4．2 技术路线

第2章 WRKY基因响应ROS或氧化胁迫

2．1 材料和方法

2．1．1 植物材料

2．1．2 植物培养及处理条件

2．1．3 基因表达分析

2．2 结果

2．2．1 WRKY基因响应过氧化氢

2．2．2 WRKY基因响应重金属镉

2．2．3 WRKY基因的时间表达分析

2．3 讨论

第3章 WRKY46调控拟南芥渗透胁迫响应以及光依赖的气孔运动

3．1 前言

3．1．1 干旱和盐胁迫引发的信号转导

3．1．2 水分胁迫下的转录调控

3．1．3 光诱导的气孔运动

3．2 问题的提出、拟解决的问题以及技术路线

3．2．1 问题的提出和拟解决的问题

3．2．2 技术路线

3．3 材料和方法

3．3．1 植物材料

3．3．2 植物培养条件

3．3．3 载体构建

3．3．4 拟南芥转基因实验

3．3．5 T-DNA插入突变体纯合株系的PCR鉴定

3．3．6 处理条件

3．3．7 叶片失水率测定

3．3．8 ABA含量测定

3．3．9 气孔运动生理实验

3．3．10 ROS检测

3．3．11 MDA含量测定

3．3．12 GUS染色及活性测定

3．3．13 保卫细胞和叶肉细胞原生质体分离

3．3．14 保卫细胞中淀粉和苹果酸含量的测定

3．3．15 基因表达分析

3．3．16 蛋白提取和Western blot测定

3．3．17 染色质免疫共沉淀

3．4 结果

3．4．1 WRKY46响应干旱和盐胁迫的诱导

3．4．2 WRKY46功能缺失突变体对干旱和盐胁迫表现敏感

3．4．3 WRKY46过表达株系的表型分析

3．4．4 过表达WRKY46影响ABA诱导的气孔关闭过程

3．4．5 WRKY46在保卫细胞中表达

3．4．6 WRKY46参与调控光诱导的气孔打开过程

3．4．7 WRKY46调控细胞渗透保护和氧化还原内稳态基因的表达

3．4．8 WRKY46调控保卫细胞的淀粉代谢

3．3 讨论

3．3．1 WRKY46作为早期因子响应干旱、盐以及氧化胁迫

3．3．2 WRKY46参与生物胁迫和非生物胁迫反应

3．3．3 WRKY46参与气孔的打开过程

第4章 WRKY46调控盐和渗透胁迫下拟南芥的侧根发育

4．1 前言

4．2 问题的提出、拟解决的问题及技术路线

4．2．1 问题的提出和拟解决的问题

4．2．2 技术路线

4．3 材料和方法

4．3．1 实验材料

4．3．2 植物培养条件

4．3．3 处理条件

4．3．4 T-DNA插入突变体纯合株系的PCR鉴定

4．3．5 GUS染色

4．3．6 IAA含量检测

4．3．7 基因表达分析

4．3．8 染色质免疫共沉淀

4．4 结果

4．4．1 WRKY46在侧根中表达

4．4．2 WRKY46的功能缺失抑制侧根在盐和渗透胁迫下的发育

4．4．3 生长素回复wrky46突变体在盐或渗透胁迫下侧根的生长

4．4．4 过表达WRKY46促进盐或渗透胁迫下侧根的发育

4．4．5 生长素、ABA、盐和渗透胁迫调控WRKY46的表达

4．4．6 WRKY46影响盐或渗透胁迫下根中的生长素水平

4．4．7 WRKY46调控盐或渗透胁迫下ABI4和生长素桥连基因的表达

4．4．8 WRKY46与ABI4和生长素桥连基因启动子体内结合

4．5 讨论

第5章 WRKY46调控铝诱导的苹果酸分泌

5．1 前言

5．1．1 植物的铝毒害机制

5．1．2 植物的耐铝机制

5．2 问题的提出、拟解决的问题及技术路线

5．2．1 问题的提出和拟解决的问题

5．2．2 技术路线

5．3 材料和方法

5．3．1 植物材料

5．3．2 植物培养条件

5．3．3 铝处理条件

5．3．4 GUS染色和活性测定

5．3．5 根系铝含量测定

5．3．6 根系有机酸分泌的测定

5．3．7 烟草叶片中的瞬时表达

5．3．8 酵母单杂实验

5．3．9 基因表达分析

5．3．10 染色质免疫共沉淀

5．4 结果

5．4．1 WRKY46响应铝

5．4．2 WRKY46的功能缺失提高拟南芥的铝耐性

5．4．3 WRKY46调控ALMT1的表达以及苹果酸的分泌

5．4．4 WRKY46通过直接结合ALMT1的启动子调控其表达

5．5 讨论

第6章 WRKY41调控拟南芥的种子休眠

6．1 前言

6．2 问题的提出、拟解决的问题及技术路线

6．2．1 问题的提出和拟解决的问题

6．2．2 技术路线

6．3 材料和方法

6．3．1 实验材料

6．3．2 植物培养条件

6．3．3 载体构建

6．3．4 拟南芥转基因实验

6．3．5 T-DNA插入突变体纯合株系的PCR鉴定

6．3．6 发芽与根伸长实验

6．3．7 干旱处理和失水率测定

6．3．8 种子ABA含量的测定

6．3．9 GUS染色

6．3．10 基因表达分析

6．3．11 蛋白提取和Western blot测定

6．3．12 烟草叶片瞬时表达实验

6．3．13 重组蛋白的纯化和凝胶阻滞实验(EMSA)

6．3．14 染色质免疫共沉淀

6．4 结果

6．4．1 WRKY41的功能缺失导致种子的初生休眠降低

6．4．2 WRKY41主要在种子中表达

6．4．3 wrky41突变体的种子萌发和幼苗生长对ABA不敏感

6．4．4 WRKY41正调控ABA信号途径和种子成熟相关基因的表达

6．4．5 WRKY41的功能缺失降低种子的热抑制休眠

6．4．6 WRKY41的功能缺失影响荚果中种子成熟相关基因的表达

6．4．7 WRKY41在种子成熟及萌发阶段调控ABI3的表达

6．4．8 WRKY41不在ABA下游调控ABI3的表达

6．4．9 WRKY41对ABI3的调控不依赖于ABA的合成代谢、ABA信号途径以及其它调控ABI3转录表达的因子

6．4．10 WRKY41体外结合ABI3启动子

6．4．11 WRKY41在烟草叶片中转录激活ABI3启动子

6．4．12 WRKY41与ABI3启动子体内结合

6．4．13 高浓度的ABA反馈调控WRKY41的表达

6．5 讨论

6．5．1 WRKY41转录激活ABI3的表达并调控种子的休眠

6．5．2 WRKY41与ABA信号途径

6．5．3 WRKY转录因子在种子发育和萌发过程中的作用

第7章 全文总结

7．1 主要研究结论

7．2 创新点

7．3 研究展望

参考文献

个人简历

博士期间发表的论文