Hc-fau基因的获得及其在捻转血矛线虫滞育过程中的调节作用

摘要

捻转血矛线虫(Haemonchus contortus)是寄生于牛、羊等反刍动物真胃内消化道寄生虫，以血液为食，给畜牧业造成极大的经济损失。“滞育”是虫体抵抗外界环境压力的有效措施，也是捻转血矛线虫病呈“春季高潮”的主要原因。因此对滞育现象的研究对于该病的防控具有重要的指导意义。本研究根据Gibbz(1971)的方法获得H.contortus ZJ株滞育虫体;采用RACE、Genome walking技术获得了滞育相关基因Hc-fau完成cDNA和全基因序列;在模式生物秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)中通过显微注射、RNA干扰技术研究该基因在虫体内的对发育的调节作用;通过脂质体转染在HEK293细胞系中研究该基因各功能域之间的关系及功能;运用SwissModel对Hc-FAU进行同源建模。研究成果将为进一步阐述H.contortus滞育机制奠定基础。
　　1.捻转血矛线虫ZJ株滞育虫体的获得及其形态特征
　　本实验参照Adams(1986)的方法，通过瘤胃灌注，将捻转血矛线虫感染性三期幼虫攻入绵羊体内，对绵羊进行处理后，获得捻转血矛线虫滞育虫体。滞育虫体发育程度一致，虫体长1067±97μm(n=18)，肠道细胞中含有大量棒状结晶块;性腺开始发育，出现雌驱器原基;颈部出现颈乳突。通过温度检测分析，温度可能不是滞育现象的主要刺激因素。棒状结晶块可以被DAPI特异性着色，其成分可能含有核酸。
　　2.Hc-fau基因的获得及其时空特异性研究
　　在研究滞育机制的过程中，我们运用RNA差异显示技术研究正常虫体与滞育虫体各基因mRNA转录水平差异，获得了一个新基因Hc-fau，其在C.elegans和哺乳动物中的同源基因分别是Ce-rps30和fau。通过RNA可变剪辑，Hc-fau可编码两种蛋白Hc-FAUA和Hc-FAUB，分别由130和107个氨基酸组成。它们均含有类泛素蛋白(UBiL)结构域和核糖体蛋白S30结构域。在iL3中，呈广泛性表达;在滞育虫体中mRNA水平显著降低。
　　3.Hc-FAU在秀丽隐杆线虫发育过程中的调节作用
　　以C.elegans为模式生物，通过显微注射和RNAi技术在C.elegans中对Ce-rps30进行过表达和基因沉默，通过检测虫体寿命、体长、产卵量和肠道中脂肪沉积情况来确定Hc-FAU调节虫体发育的功能。结果表明，当过表达Hc-faua及过表达Ce-rps30时，虫体特征没有显著差别，但虫体寿命缩短，不能够正常发育产卵;过表达Hc-faua-ubil和Hc-faub-ubil时，虫体可以正常发育至成虫，虫体可以产卵，但产卵量显著降低;过表达Hc-fau-s30时，虫体体细胞不能正常发育，但性腺可发育至成熟，且可以产卵，但不能够排出体外而形成死胎;过表达Hc-faub时虫体F2代虫卵不能够孵化。在C.elegans中对Ce-rps30进行基因沉默后，虫体寿命延长，但发育速度显著减慢，且不能发育至成虫，不能产卵，体内脂肪储存增加。通过表型分析，UBiL与S30结构域对于体细胞和性腺细胞的调节具有协同作用;且UBiL主要调节性腺细胞的发育，而S30结构域主要调节体细胞的发育。为了进一步探寻C.elegans RNAi虫体中可能与Ce-rps30有关系的基因，我们分别检测了IIS，TGF-β，cGMP，dafachronic acid(DA)，细胞凋亡(AP)和脂肪酸代谢(FA)相关基因中mRNA水平。结果显示除了daf-16和akt-1显著升高外，其它基因均显著降低。而daf-16的下游基因也显著降低，且虫体抗热应激能力没有显著增加，因此，在C.elegansRNAi虫体中AKT-1对DAF-16的磷酸化作用起到较强的作用，可能DAF-16高表达起到了其他的作用。
　　4.Hc-FAU天然融合蛋白现象的初步研究
　　Hc-FAU是天然融合蛋白，由UBiL和S30融合表达后被裂解成两个蛋白。为了研究这种天然融合蛋白现象，本研究在HEK293细胞系中表达Hc-fau，通过表达时间及对HEK293细胞系进行处理，观察融合蛋白的变化。并通过Westernblot检测蛋白的裂解情况，表明Hc-FAUA在细胞中既有融合的形式，也有裂解的形式。而Hc-FAUB主要以融合的形式存在。在单独表达UBiL或是S30结构域时，它们可以与其它蛋白相互作用。通过SwissModel对结构域进行预测，Hc-FA UB在N端比Hc-FAUA缺少的23个氨基酸由2个β折叠和1个α螺旋组成，结合试验，这个结构对于Hc-FAUA-UBiL的功能起到抑制的作用。通过结构预测与试验验证，验证了S30的核定位信号，并鉴定出了其核仁定位信号。
　　综上所述，Hc-fau对于H.contortus L4滞育可能具有很重要的调节作用，探明Hc-fau在H.contortus L4滞育过程的调节机制将为捻转血矛线虫病的防控提出新视角。

目录

声明

论文说明

摘要

前言

第一部分 文献综述

第一章 捻转血矛线虫及其危害

1 捻转血矛线虫概述

2 捻转血矛线虫病

3 小结

第二章 秀丽隐杆线虫

1 秀丽隐杆线虫概述

2 秀丽隐杆线虫作为模式生物的优势

3 秀丽隐杆线虫的研究现状

4 秀丽隐杆线虫作为模式生物在寄生性线虫研究中的应用

5 小结

第三章 滞育现象

1 寄生性线虫滞育现象

2 捻转血矛线虫滞育现象

3 秀丽隐杆线虫滞育机制的研究

4 小结

第二部分 研究内容

第四章 捻转血矛线虫ZJ株滞育虫体的获得及其形态特征

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

第五章 Hc-fau基因的获得及其时空特异性研究

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

第六章 Hc-FAU在秀丽隐杆线虫发育过程中的调节作用

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

第七章 Hc-FAU天然融合蛋白现象的初步研究

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

结论

创新点

展望

附录

参考文献

攻读博士学位期间的主要成果

致谢