水稻PHR1家族高亲和顺式作用元件HA-P1BS的发现与应用研究

摘要

磷(Phosphate，P)是植物生长所需大量必需元素之一;磷营养在植物生长发育中发挥着重要作用，对农作物的丰产不可或缺。在植物磷信号调控网络中，PHR1(Phosphate Starvation Response1)作为网络中心调控因子，调控植物磷信号与磷平衡。PHR1结合的顺式作用元件（cis-element）(PHR1-binding sequence:P1BS)已被揭示，本研究旨在研究P1BS对水稻中PHR1的同源基因OsPHR2的亲和力的影响，探索利用高亲和顺式作用元件对作物进行磷吸收作用的遗传改良。
　　利用酵母单杂(Yeast-one-hybridization)和凝胶阻滞分析（Electrophoreticmobility shift assay，EMSA）技术，发现OsPHR2对不同下游调控基因OsIPS1、OsIPS2、OsPT和OsPHF1的亲和力存在显著差异，其中对OsIPS2的P1BS亲和力最高，而对OsPT2的亲和力最低。
　　通过进一步研究发现，有两个因素影响着OsPHR2对P1BS的亲和力:一是P1BS旁侧P1BS-like序列，二是P1BS的可变碱基。当仅有P1BS序列存在时，OsPHR2不能有效识别P1BS;只有当P1BS与P1BS-like同时存在时，OsPHR2才能与P1BS有效结合。通过对OsIPS2的P1BS1可变碱基的逐一替换发现，当第一个可变碱基‘A’替换为‘T'、‘C’或‘G’时，OsPHR2对P1BS1的亲和力都显著下降;当第二个可变碱基‘G’替换为‘A’或‘C’时，OsPHR2对P1BS1的亲和力并没有发生显著改变，而当‘G’替换为‘T’时，OsPHR2对P1BS1的亲和力显著增加。由此说明P1BS第一个可变碱基是‘A’时较有利于OsPHR2的结合，并且当第一个和第二个可变碱基是‘A-T’组合(A-T-type)时最有利于OsPHR2与P1BS的稳定结合。在P1BS1为A-T-type的条件下，对P1BS-like进行趋向于A-T-type-P1BS的替换，结果发现P1BS-like变为A-T-type-P1BS时能进一步提高OsPHR2的亲和力。由此本研究获得了一个OsPHR2高亲和的P1BS-P1BS-like组合元件:A-T-type-P1BS-A-T-type-P1BS，即HA-P1BS。
　　随后，本研究利用HA-P1BS对OsPHF1（Phosphate Transporter TrafficFacilitator1）启动子进行了改造。酵母单杂和EMSA技术分析结果表明，OsPHR2对HA-P1BS改造后的OsPHF1启动子亲和力显著提高了。利用OsPHF1启动子和HA-P1BS改造启动子融合GUS的转基因材料进一步证明HA-P1BS能提高OsPHF1表达水平。通过GUS组织切片分析发现，由HA-P1BS启动的OsPHF1组织表达没有发生变化。因此，本研究发展了P OsPHF1-HA-P1BS: PHF1(CDS)的转基因材料(即:PHF1-HA-P1BS)，用于分析HA-P1BS改造后的OsPHF1能否提高植株的磷吸收效率。溶液培养结果表明，在200μM和10μM Pi条件下，两个独立转基因株系在叶片中的有效磷都要显著高于野生型，但并不影响植株正常生长。33p吸收动力学实验进一步证实PHF1-HA-P1BS的磷吸收能力要显著高于野生型。通过在高磷和低磷条件下的盆栽实验发现，PHF1-HA-P1BS表现出了耐低磷的特性:转基因材料单株产量以及种子与植株总磷含量显著增加。
　　综上所述，本研究揭示了顺式作用元件P1BS可变碱基和P1BS-like基序对磷信号与磷平衡中心调控转录因子OsPHR2亲和力的影响;同时利用HA-P1BS改良了OsPHF1基因启动子，使其提高表达，提高作物磷吸收效率，本研究为作物的遗传改良提供了新的途径。

目录

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致谢

摘要

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缩略语表

第1章 文献综述

1．1 PHR1调控植物对磷响应的机制

1．1．1 PHR1-IPS1-miR399-PHO2-PT途径

1．1．2 PHR1-miR827途径

1．1．3 PHR1-PT途径

1．2 PHRs转录活性调控

1．2．1 PHR1的SUMO修饰

1．2．2 SPXs对PHRs转录功能的调控

1．3 DNA结构对基因表达的调控

1．4 PHF1

1．5 研究目标

第2章 顺式作用元件P1BS对OsPHR2亲和力的调控

2．1 材料

2．2 方法

2．2．1 水稻溶液培养条件

2．2．2 酵母单杂交实验

2．2．3 凝胶阻滞EMSA实验

2．2．4 P1BS-P1BS-like LOGO分析

2．3 实验结果

2．3．1 OsPHR2对不同下游调控基因的亲和力差异

2．3．2 P1Bs-P1BS-like决定OsPHR2对DNA的识别

2．3．3 P1BS可变碱基对OsPHR2 DNA亲和力进行精细调控

2．4 本章小结

第3章 高亲和顺式作用元件HA-P1BS在作物改良上的运用

3．1 材料

3．2 方法

3．2．1 发展POsPHF1-GUS(WT)及POsPHF1-GUS(HA)转基因材料

3．2．2 发展PHF1-HA-P1BS转基因材料

3．2．3 GUS活性定量测定

3．2．4 GUS组织染色及切片

3．2．5 转基因水稻有效磷测定

3．2．6 转基因水稻33P吸收分析

3．2．7 PHF1-HA-P1BS转基因植株盆栽实验

3．2．8 植物微波消解及ICP-OES总磷测定

3．3 实验结果

3．3．1 HA-P1BS能有效提高OsPHF1启子的转录效率

3．3．2 PHF1-HA-P1BS转基因植株能有效提高磷的利用效率

3．3．3 PHF1-HA-P1BS转基因植株具有耐低磷的特性

3．4 本章小结

第4章 讨论

4．1 P1BS-P1BS-like是PHRs结合DNA必需的结构

4．2 P1BS可变碱基对OsPHR2 DNA亲和力的精细调控

4．3 HA-P1BS在作物改良方面的运用

参考文献

附录

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