内置双重安全控制机制的水稻生物反应器表达药物蛋白质

摘要

转基因技术已广泛应用于作物农艺性状改良及生物反应器生产具有重要市场价值的医药及工业用蛋白。但是，其在给人类社会带来利益的同时，也存在着基因漂移和转基因种子意外传播的潜在风险。现有的防止基因漂移的技术只能对转基因植物研发及应用过程中的某个阶段进行监测。已有的检测转基因种子意外传播的方法大都繁琐且费时费力。必须发展安全可靠的转基因安全控制技术和简单易行的检测识别技术。为此，本论文发明了苯达松选择性杀灭转基因水稻植株和颜色识别转基因水稻种子的双重安全控制技术，并利用该技术表达人胰岛素原和依那西普。 所获得的主要结果如下: (1)我们研究获得一种预置了双重安全控制技术的生物反应器转基因水稻。利用RNAi技术抑制苯达松解毒酶基因CYP81A6的表达，使水稻丧失原有的苯达松抗性。同时，利用远红荧光蛋白基因mKateS158A作为标记基因使转基因水稻能够用肉眼识别。将抗草甘膦基因表达框、苯达松解毒酶基因的RNAi表达框，以及远红荧光蛋白和人胰岛素原的融合蛋白质表达框克隆在同一个T-DNA载体中。利用农杆菌介导转化法，获得272个独立的转基因水稻株系。通过肉眼直接观察、PCR检测、Western blot、Southern blot以及除草剂敏感性检测试验等进行鉴定与分析。结果表明，株系R-6、R-11和R-42不但具有红色种子、高表达人胰岛素原、对苯达松敏感，而且为单拷贝株系。因此，我们培育的转基因水稻不仅成功表达了人胰岛素原，而且具有双重安全控制机制。在生产阶段，可喷施常规剂量的苯达松杀灭常规水稻中可能混入的转基因水稻;在加工阶段，可以肉眼发现红色警示标记的转基因水稻种子。最重要的是，消费者在消费阶段能够方便的检查粮食中是否污染转基因水稻。该双重安全控制机制极大地确保了生物反应器水稻的安全研发与释放以及粮食作物的安全生产，也为培育能够生产其他具有发展前景的医药及工业用蛋白的转基因水稻提供了技术支持。 (2)依那西普（商品名Enbrel）是抗肿瘤坏死因子最有效的药物之一，面对非常大的市场需求量，传统生产体系的生产能力面临很大挑战。本研究选择以水稻种子为平台，探索生产该蛋白的新方法。根据已发表的Enbrel氨基酸序列，人工合成经密码子优化的该基因，并将其克隆于含有苯达松解毒酶基因CYP81A6的RNAi表达框的载体中。采用农杆菌介导转化法，以草甘膦作为筛选剂，获得了113个转基因株系。Southernblot、Western blot、以及苯达松敏感性检测试验表明，株系Enb-7和Enb-19为单拷贝株系，它们不仅成功表达了Enbrel，而且对苯达松敏感。这种表达Enbrel的生物反应器水稻中预置了选择性杀灭机制，必要时可非常简单方便地通过喷施草甘膦或苯达松，有目的地选择出或灭杀掉转基因水稻。

目录

论文说明

声明

致谢

摘要

缩略词表

1 文献综述

1．1 转基因植物的安全性

1．1．1 转基因植物的环境安全性

1．1．2 转基因植物的食用安全性

1．2 转基因植物安全控制的生物学手段

1．2．1 解决转基因植物的环境安全性问题的分子策略

1．2．2 常用检测转基因食品的方法

1．3 苯达松

1．3．1 苯达松的作用机理

1．3．2 水稻苯达松解毒酶CYP81A6基因

1．4 红色荧光蛋白的研究及应用进展

1．4．1 红色荧光蛋白的研究进展

1．4．2 红色荧光蛋白在转基因植物上的应用进展

1．5 植物生物反应器

1．5．1 植物生物反应器的研究进展

1．5．2 植物生物反应器的安全性

1．6 胰岛素及其在基因工程上的研究进展

1．6．1 胰岛素

1．6．2 胰岛素在基因工程上的研究进展

1．7 依那西普

1．8 本研究的目的和意义

2 材料和方法

2．1 材料

2．1．1 植物材料

2．1．2 常用实验菌株及载体

2．1．3 主要工具酶

2．1．4 常用试剂、核酸、蛋白分子质量及试剂盒

2．1．5 各种培养基的配置

2．1．6 常用生化试剂和仪器

2．2 论文中用到的分子生物学实验方法

2．2．1 PCR技术

2．2．2 DNA琼脂糖凝胶电泳

2．2．3 凝胶回收

2．2．4 高保真酶扩增产物加A反应

2．2．5 连接反应

2．2．6 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化

2．2．7 重组质粒的提取

2．2．8 酶切反应

2．2．9 菌株保存

2．2．10 农杆菌感受态细胞的制备及转化

2．2．11 原核表达

2．2．12 植物基因组DNA的提取(CTAB法)

2．2．13 Western blot

2．2．14 Southern blot

2．2．15 植物总RNA提取、纯化和cDNA第一链的合成

2．2．16 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)

3 内置双重安全控制机制的水稻生物反应器表达人胰岛素原

3．1 方法

3．1．1 远红荧光蛋白与人胰岛素原融合基因的原核表达

3．1．2 水稻转化载体的构建

3．1．3 根癌农杆菌介导的水稻遗传转化

3．1．4 转基因水稻的鉴定与分析

3．1．5 转基因水稻对苯达松敏感性及抗草甘膦性能测定

3．2 结果与分析

3．2．1 原核表达结果

3．2．2 水稻转化载体的鉴定

3．2．3 转基因水稻的获得

3．2．4 转基因水稻的PCR鉴定

3．2．5 目的基因在转基因水稻中的表达情况

3．2．6 转基因水稻对除草剂的敏感性

3．2．7 苯达松解毒酶基因CYP81A6的表达差异

3．2．8 外源基因与植物基因组整合的Southern blot分析

3．3 小结与讨论

4 利用可选择性杀灭水稻表达依那西普的研发

4．1 方法

4．1．1 水稻转化载体的构建

4．1．2 根癌农杆菌介导的水稻遗传转化

4．1．3 转化Enbrel基因水稻的鉴定与分析

4．1．4 转基因水稻对苯达松的敏感性测定

4．2 结果与分析

4．2．1 水稻转化载体的鉴定

4．2．2 转基因水稻的获得

4．2．3 外源基因与水稻基因组的整合

4．2．4 目的基因在转基因水稻中表达情况分析

4．2．5 转基因水稻对除草剂敏感性分析

4．2．6 转化Enbrel基因水稻的Southern印迹分析

4．3 小结与讨论

5 全文总结

5．1 总讨论

5．1．1 内置双重安全控制机制的水稻生物反应器表达人胰岛素原

5．1．2 利用可选择性杀灭水稻表达依那西普的研发

5．2 创新之处

5．3 下一步的研究

参考文献

附录

作者简介