同轴电喷-去模板法制备核壳纳米颗粒及其在药物传递领域的应用

摘要

利用电喷技术制备高分子颗粒药物载体具备诸多优势，包括操作简单，一步法即可完成载体的制备和药物的包载;可控性好，通过调整参数可制备粒径均一的颗粒;药物包埋率高，且同轴电喷可同时包载多种不同性质的药物。但是电喷技术制备的高分子颗粒尺寸较大，一般在微米到亚微米范围，通过调整制备参数调节颗粒粒径的幅度有限。
　　相比于微米颗粒，纳米颗粒在流动性、靶向性、血液循环时间、细胞摄取等方面优势明显。因此，本文提出三层同轴电喷-去模板法，将制备的高分子颗粒的粒径减小至纳米尺度。该方法首先利用三层同轴电喷制备具有多层结构的高分子微米颗粒，再选用合适的溶剂脱除颗粒的冠层模板以达到减小颗粒粒径的目的。
　　以聚（乳酸-羟基乙酸）(PLGA)为材料，通过优化单轴电喷过程中溶剂、溶液浓度、进样速度、加载电压等参数，对颗粒的形貌和粒径实施调控;通过比较颗粒形貌，选择了分子量为20 kDa的聚乙二醇(PEG)为三层同轴电喷模板材料。分别以PLGA和PEG为内、外层材料进行同轴电喷制备颗粒，为了避免生成纤维，在单轴电喷的基础上适当降低PLGA溶液的浓度。
　　分别以牛血清白蛋白(BSA)、PLGA和PEG为核、壳、冠层材料，利用三层同轴电喷制备得到粒径为1.8±0.8μm的球状颗粒，激光共聚焦(LSCM)图片显示颗粒呈现清晰的核-壳-冠结构。经水溶脱除PEG模板后，颗粒粒径减小至94±8 nm，扫描电镜(SEM)、透射电镜(TEM)和原子力显微镜（AFM）表征结果显示颗粒保持规则的球状和光滑的表面。通过改变壳层PLGA溶液的进样速度，可以调控纳米颗粒的粒径，当进样速度降为0.5 ml/h时，所得纳米颗粒粒径降至68±8 nm。利用考马斯亮蓝法研究发现颗粒的蛋白质载药量为3.7±1.2％、包埋率为78.3±5.3％、体外释放时间达到60 h。利用圆二色谱技术分析了释放蛋白质的圆二色吸收特性，发现电喷过程对蛋白质的二级结构几乎没有影响。
　　为了提高颗粒表面的亲水性，以两亲性嵌段高分子聚乳酸-b-聚乙二醇(PLA-b-PEG)为材料，利用单轴电喷考察材料的电喷性能。结果显示制备得到表面光滑的球状颗粒，且表面水接触角结果显示PLA-b-PEG颗粒表面的亲水性显著强于PLGA颗粒。分别以PEG、PLA-b-PEG和PEG为核、壳、冠层材料，利用三层同轴电喷-去模板法制备得到粒径约100 nm的颗粒。LSCM图片显示随着冠层溶液进样速度的增加，冠层壁厚显著增加。粒径统计结果表明通过改变冠层溶液进样速度，可以同时调控微米颗粒和纳米颗粒的粒径。通过粒径测试发现PLA-b-PEG纳米颗粒在去离子水中30天内未发生团聚，在PBS和RPMI1640细胞培养液中也表现出较长时间的分散稳定性。MTT结果显示PLA-b-PEG纳米颗粒具有良好的生物相容性。利用流式细胞仪考察了肿瘤细胞A549对颗粒的细胞摄取行为、摄取机制和排泄行为。结果表明该细胞系可以大量摄取PLA-b-PEG纳米颗粒，摄取呈现浓度和时间依赖性，摄取过程可能与小凹蛋白介导的途经相关、与网格蛋白介导的途径无关，24 h时约有45％的颗粒被排出细胞;利用LSCM观察了颗粒在细胞内的分布，发现颗粒富集于细胞核外，部分进入溶酶体，没有颗粒进入线粒体。
　　以疏水性抗肿瘤药物紫杉醇(PTX)为模型药物，包载于PLA-b-PEG纳米颗粒，利用高效液相色谱(HPLC)考察了载药量、包埋率和药物释放行为。通过调节药物溶液进样速度，载药量可以达到50.7±1.5％，包埋率高达70％以上;纳米颗粒对药物表现出良好的缓释作用，体外释放时间长达40天以上。此外，还考察了载药量、载药位置、释放介质对PTX体外释放行为的影响，发现药物的释放速度随着载药量的增加、释放介质pH值的降低和加入蛋白酶而加快，但是载药位置对药物释放速度没有显著影响。利用Ritger-peppas方程模拟了PTX的释放机理，结果表明药物从PLA-b-PEG纳米颗粒中的释放同时受到扩散和骨架溶蚀的控制，当释放介质pH为5.0且加入酶的条件下，骨架溶蚀是PTX从载体中释放的主要驱动力。利用MTT法评价了载药颗粒的体外抗肿瘤疗效，结果发现该药物传递系统的细胞毒性随着培养时间的延长而增大。

目录

声明

致谢

摘要

第1章 绪论

1．1 高分子微纳米颗粒在药物传递领域的应用

1．1．1 高分子微纳米颗粒DDS提高难溶性药物的生物利用度

1．1．2 高分子微纳米颗粒DDS保护药物的结构与功能

1．1．3 高分子微纳米颗粒DDS用于靶向输送

1．1．4 高分子微纳米颗粒DDS用于药物控制释放

1．2 高分子微纳米颗粒药物传递系统的制备方法

1．2．1 乳化法

1．2．2 纳米沉淀法

1．2．3 喷雾干燥法

1．2．4 新方法

1．3 电喷技术制备高分子药物传递系统

1．3．1 电喷技术的基本原理

1．3．2 单轴电喷技术制备高分子药物传递系统

1．3．3 多轴电喷技术制备高分子药物传递系统

1．3．4 电喷技术制备高分子颗粒的粒径

1．4 微纳米颗粒DDS的粒径对其应用的影响

1．4．1 颗粒粒径对其体内组织渗透和生物分布的影响

1．4．2 颗粒粒径对其细胞胞吞及胞内分布的影响

1．5 课题提出

第2章 电喷法制备高分子微米颗粒及参数优化

2．1 前言

2．2 实验部分

2．2．1 实验材料与仪器

2．2．2 单轴电喷技术制备PLGA颗粒

2．2．3 单轴电喷技术制备EC颗粒

2．2．4 单轴电喷技术制备PEG颗粒

2．2．5 同轴电喷技术制备PLGA／PEG颗粒

2．2．6 电喷溶液黏度测定

2．2．7 电喷颗粒的形貌表征与粒径统计

2．2．8 高分子材料和电喷颗粒的热分析

2．3 结果与讨论

2．3．1 PLGA颗粒的制备及各参数对颗粒性质的影响

2．3．2 模板材料的选择

2．3．3 同轴电喷制备PLGA／PEG颗粒

2．4 本章小结

第3章 PLGA核壳纳米颗粒的制备及其负载蛋白质药物的研究

3．1 前言

3．2 实验部分

3．2．1 实验材料与仪器

3．2．2 三层同轴电喷法制备BSA／PLGA／PEG微米颗粒

3．2．3 去模板制备BSA／PLGA纳米颗粒

3．2．4 微米颗粒与纳米颗粒的表征

3．2．5 BSA的包载与体外释放

3．2．6 BSA二级结构的表征

3．2．7 统计分析

3．3 结果与讨论

3．3．1 三层同轴电喷制备得到微米颗粒的形貌和结构

3．3．2 去模板后纳米颗粒的形貌与粒径

3．3．3 纳米颗粒的粒径调控

3．3．4 模型蛋白BSA的体外释放及二级结构表征

3．4 本章小结

第4章 PLA-b-PEG核壳纳米颗粒的制备及性能研究

4．1 前言

4．2 实验部分

4．2．1 实验材料与仪器

4．2．2 两亲性嵌段共聚物PLA-b-PEG的合成与表征

4．2．3 PLA-b-PEG单轴和PLA-b-PEG／PEG同轴电喷颗粒的制备及表征

4．2．4 PLGA、PEG、PLA-b-PEG电喷颗粒的表面水接触角测试

4．2．5 三层同轴电喷-去模板法制备PLA-b-PEG纳米颗粒及其表征

4．2．6 PLA-b-PEG纳米颗粒在水相介质中的分散稳定性

4．2．7 PLA-b-PEG纳米颗粒的细胞毒性

4．2．8 PLA-b-PEG纳米颗粒的细胞摄取

4．2．9 PLA-b-PEG纳米颗粒的细胞内分布

4．2．10 PLA-b-PEG纳米颗粒的细胞排泄

4．2．11 统计分析

4．3 颗粒制备的实验结果与讨论

4．3．1 PLA-b-PEG嵌段共聚物的表征

4．3．2 PLA-b-PEG单轴电喷颗粒的形貌和性质研究

4．3．3 PLA-b-PEG／PEG同轴电喷颗粒的形貌

4．3．4 PLA-b-PEG核壳纳米颗粒的制备与粒径调控

4．4 PLA-b-PEG纳米颗粒性能研究的实验结果与讨论

4．4．1 PLA-b-PEG纳米颗粒的分散稳定性

4．4．2 PLA-b-PEG纳米颗粒的细胞毒性

4．4．3 PLA-b-PEG纳米颗粒的细胞摄取动力学

4．4．4 PLA-b-PEG纳米颗粒的细胞摄取机制

4．4．5 PLA-b-PEG纳米颗粒的细胞内分布

4．4．6 PLA-b-PEG纳米颗粒的细胞排泄

4．5 本章小结

第5章 PLA-b-PEG纳米颗粒对PTX的载药释药行为研究及体外药效学评价

5．1 前言

5．2 实验部分

5．2．1 实验材料与仪器

5．2．2 载药颗粒的制备与表征

5．2．3 颗粒的载药量与包埋率检测以及体外释放研究

5．2．4 载药颗粒的体外药效学评价

5．3 结果与讨论

5．3．1 PLA-b-PEG颗粒对PTX的负载行为

5．3．2 药物的体外释放行为

5．3．3 载药颗粒的体外药效学评价

5．4 本章小结

第6章 总结与展望

6．1 全文总结

6．2 展望

参考文献

中英文缩写对照表

作者简介与在学期间相关科研成果