胎盘来源间充质干细胞在肝衰竭治疗中的应用及其代谢组学机制研究

摘要

研究背景：
　　急性肝功能哀竭(acute liver failure，ALF)是一类由各种原因引起的，以短期内肝细胞大量坏死、进展迅速的肝性脑病和严重的肝功能损害为特征，并产生一系列并发症的严重的肝功能障碍性疾病。发病率高，病死率更是高达70-80％，是目前医学上最棘手的难题之一。近年，干细胞因其多向分化潜能，应用于移植治疗急性肝衰竭成为研究热点。
　　干细胞在一定的内环境下能够定向分化为类肝细胞，分泌相关细胞因子，促进受损肝脏的修复和再生。间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)是干细胞家族的重要成员，因其来源广泛、具有高度的自我复制能力和多向分化潜能，以及独特的低免疫原性等而成为细胞移植合适的细胞源。骨髓来源的MSC是目前研究最为广泛深入的种子细胞，但其受来源、MSC含量低等限制。现已发现MSC还可来源于脐血、脐带、脂肪和胎盘等多种组织。特别是胎盘来源的间充质干细胞(human placental mesenchymal stem cells，hPMSCs)，和骨髓MSC有着极其一致的生物学特性，且免疫源性更低，增殖分化能力更强。同时胎盘在临床上为废弃物，取材几乎不受限制，且不涉及伦理问题;因此，它不但能够成为骨髓MSC的理想替代物，而且有更广阔的应用潜能。本研究拟分离、培养胎盘来源的间充质干细胞，并进行生物学特征鉴定。
　　ALF发病机制非常复杂，建立一个稳定可靠的动物模型至关重要。目前国内外研究肝损伤修复的模型大多采用小鼠、大鼠等啮齿类动物，本研究拟采用中国小型猪，利用半乳糖胺（D-galactosamine，GalN）诱导法建立稳定的ALF动物模型，通过hPMSCs细胞移植来研究治疗的可行性和安全性，并进行疗效判断。为hPMSCs移植治疗肝衰竭的临床应用奠定实验基础。
　　肝脏是人体重要的代谢器官，肝功能衰竭时血清中很多内源性物质的浓度会升高，如芳香族氨基酸、胆红素、自由脂肪酸、血清氨、苯二氮卓类以及促炎症细胞因子等。随着病情的发展，体内众多内源性代谢物的水平也在发生相应的变化。代谢组学是近年发展起来的一种系统生物学方法，能准确而全面的测定生物体体液中小分子代谢物的变化，反映外界刺激或遗传修饰下生物体的代谢应答变化，其研究对象主要是相对分子质量在1000以下的内源性小分子代谢物。本研究将采用代谢组学手段，揭示在ALF病情发展和hPMSCs移植治疗ALF的全过程中内源性代谢物的动态变化模式，分析细胞移植治疗对ALF代谢谱的影响;从代谢组学角度揭示细胞移植治疗急性肝衰竭的分子机制。
　　方法：
　　采用胶原酶消化、密度梯度离心法进行胎盘来源的间充质干细胞的分离、培养，然后进行生物学特征鉴定，包括流式细胞术测定细胞表面标志;成骨、成脂、成肝定向诱导分化;对体外诱导出的类肝细胞进行肝细胞功能测定。
　　采用颈静脉注射半乳糖胺的方法建立中国小型猪ALF动物模型。造模后分为四组:A:无细胞移植组;B: hPMSCs通过颈静脉途径移植组;C:致死剂量X线照射的hPMSCs门静脉途径移植组;D: hPMSCs门静脉途径移植组。采集移植前后外周血，肝穿和尸检取肝组织，通过分析造模前后和不同移植途径中国小型猪存活率、血清生化指标、肝组织免疫组化染色和分子生物学测定，评价hPMSCs移植治疗的合适途径及疗效。
　　采用基于超高效液相色谱与串联四级杆飞行时间质谱仪联用技术（ultraperformance liquid chromatography combined with time-of-flight mass spectrometry,UPLC-Q/TOF-MS)的代谢组学方法，对造模前后和细胞移植前后采集的血清进行代谢组学分析。用MarkerLynx XS(ver.4.1)(Waters Co.，Mil-ford，MA)和SIMCA-P+12.0(Umetrics AB，Sweden)等软件进行多元统计分析。
　　结果：
　　从胎盘中分离到的hPMSCs在体外可长期培养，高表达HLA-Ⅰ，CD29，CD73，CD13和CD90，几乎不表达HLA-Ⅱ，CD45％，CD34，CD133，CD31和CD79b，在体外能定向诱导分化为成骨细胞、脂肪细胞和有功能的类肝细胞。
　　多元统计分析结果显示肝衰竭对照组与细胞移植组的代谢谱动态变化有显著差别，模型猪的正常生理代谢被干扰，急性肝衰竭过程中出现明显的代谢紊乱。甘氨熊脱氧胆酸(GUDCA)、甘氨鹅脱氧胆酸(GCDCA)和芳香族氨基酸（AAA），在急性肝衰竭过程中含量明显增加;与之相反是磷脂酰胆碱(PC)、溶血磷脂酰胆碱(LPC)和鞘磷脂(SM)在急性肝衰竭过程中明显下降。细胞经门静脉途径移植后，模型猪肝脏功能显著改善，丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、胆碱酯酶(CHE)、总胆红素(TBIL)和总胆汁酸(TBA)浓度逐渐恢复到正常范围;细胞移植后，代谢紊乱得到缓解改善，代谢物最终接近正常对照组。从代谢轨迹分析得到的结果与从生化数据分析和组织学检查所得到的结果相一致。同时，组化染色结果表明，肝脏炎症反应明显改善，肝细胞变性和坏死得以缓解;而其他三组指标改变不明显。门静脉移植组与其他三组比较，7天存活率明显延长并有显著性差异。免疫组化和反转录酶-聚合酶链锁反应(RT-PCR)结果表明门静脉移植途径动物肝脏中有人细胞的定植。
　　结论：
　　人胎盘来源的间充质干细胞在体内外都可以定向分化为有功能的类肝细胞，细胞移植后可显著延长模型猪的存活时间。门静脉移植途径优于颈静脉移植。B超定位下的门静脉移植hPMSCs可作为治疗肝脏疾病的新手段。代谢组学可用于揭示hPMSCs移植后ALF恢复分子机制，为肝脏疾病的干细胞疗法提供了实验基础。

目录

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论文说明

致谢

摘要

主要缩略词表

插图和附表清单

第一部分：人胎盘来源的间充质干细胞体外培养和鉴定

1．前言

2．材料和方法

3．结果

4．讨论

5．结论

第二部分：hPMSCs移植治疗急性肝衰竭的实验研究

1．前言

2．材料和方法

3．结果

4．讨论

5．结论

第三部分：hPMSCs移植治疗ALF的代谢组学研究

1．前言

2．材料和方法

3．结果

4．讨论

5．结论

全文结论

创新点

参考文献

附录

文献综述

作者简历及在学习工作经历与主要科研成果