钙离子电压门控通道调节溶酶体与内涵体和自噬体融合及其维持神经系统稳态平衡的功能研究

摘要

本文对钙离子电压门控通道调节溶酶体与内涵体和自噬体融合及其维持神经系统稳态平衡的功能进行了研究。细胞自噬通过溶酶体介导的降解系统防止有害物质在细胞内的积累，来维持细胞的稳态平衡，是一个在进化上高度保守的细胞生物学过程。在一个旨在获得能导致神经系统功能异常突变的大规模正向遗传筛选中，我们得到了7个cacophony(cac)基因的突变体，它们的感光神经元终端随着时间的增长逐渐积累了大量自噬泡，并且最终导致了神经元终端和周围神经胶质细胞的退行性变化。cac编码果蝇突触囊泡与细胞膜融合和神经递质释放所必需的钙离子电压门控通道(VGCC)的α1亚基。我们发现cac突变感光神经元终端积累了大量溶酶体和自噬体的融合中间体，提示自噬泡与溶酶体之间的融合过程可能存在障碍。缺失编码VGCC另一个亚基的基因stj得到了和cac突变相似的表型，说明整个VGCC都参与调节了自噬泡与溶酶体之间的融合。同时，我们发现VGCC对神经系统中细胞自噬的调节在进化上是高度保守的，因为小鼠中cac和stj的同源基因Cacna1a和Cacna2d2的突变都会导致小鼠小脑出现自噬障碍。而且我们还发现CACNA1A定位于溶酶体上，溶酶体上的而不是细胞膜上的CACNA1A的钙离子通道活性是溶酶体与内涵体及自噬体发生融合所必需的。提出了一个模型，在神经细胞中，VGCC在溶酶体膜上通过钙离子通道活性来促进溶酶体与自噬体的融合，从而调节细胞自噬，在维持神经元稳态平衡中发挥重要作用。

目录

声明

致谢

摘要

缩略词表

1 引言

1．1 细胞自噬

1．2 溶酶体融合及其功能

1．3 钙离子电压门控通道(voltage gated calcium channel，VGCC)

2 材料与方法

2．1 主要仪器和设备

2．2 实验动物

2．2．1 果蝇品系

2．2．2 小鼠品系

2．3 抗体和试剂

2．4 主要溶液的配制

2．5 果蝇组织的免疫组化

2．6 小鼠小脑的形态学分析和免疫组化

2．6．1 组织包埋与石蜡切片

2．6．2 苏木精—伊红染色

2．6．3 免疫组织化学

2．6．4 细胞凋亡检测(TUNEL assay)

2．7 免疫印记

2．8 小鼠小脑原代神经元培养

2．9 透射电镜分析

2．9．1 果蝇组织

2．9．2 小鼠组织

2．10 荧光染色分析

2．10．1 免疫荧光

2．10．2 LysoTracker染色

2．10．3 DQ-BSA内吞实验

2．11 钙离子成像实验

2．12 溶酶体分离实验

2．13 统计学分析

3 结果

3．1 cac是感光细胞(photoreceptor cells)维持正常功能所必需的基因

3．2 cac突变果蝇的感光神经元终端发生神经退行性改变并伴有细胞自噬异常

3．3 VGCC突变导致的自噬泡—溶酶体融合障碍与神经递质释放缺陷无关

3．4 VGCC突变小鼠小脑同样存在神经退行性改变并伴有细胞自噬异常

3．5 CACNA1A定位于溶酶体上

3．6 Cacna1a突变神经元存在溶酶体融合障碍

3．7 定位于溶酶体而非质膜上的CACNA1A是溶酶体融合所必需的

4 讨论

参考文献

作者简历及在学期间所取得的科研成果