铁皮石斛病原真菌分离与鉴定及印度梨形孢促生作用研究

摘要

铁皮石斛，兰科石斛属多年生植物，常附生于密林树干或岩石上。现代药理学研究及临床应用结果证明铁皮石斛具有增强机体免疫力，促进消化，护肝利胆等作用，在医用、食用及保健领域均有着广泛的应用前景。然而，野生铁皮石斛资源稀少，随着市场需求量的增加，越来越多的人选择人工种植铁皮石斛。
　　在铁皮石斛种植和生长的过程中，常发生各种病害，目前对铁皮石斛病害及其防治尚缺乏系统的研究。因此，本文主要在以下两个方面进行了一些初步的探索:1、对引起铁皮石斛病害的病原菌进行分离和鉴定，同时，研究病原菌的生物学特性及对部分杀菌剂敏感性。2、测定了内生真菌印度梨形孢(Piriformospora indica)对铁皮石斛的促生作用，并对印度梨形孢的转化体系进行了初步探索。主要研究结果如下:
　　(1)通过铁皮石斛病害样本的采集和病原分离，以及形态学和分子生物学鉴定，共明确了4种常见铁皮石斛病害的病原菌。分别是引起茎腐病铁皮石斛白绢病的齐整小核菌Sclerotium rolfsii、引起铁皮石斛黑斑病的极细链格孢Alternaria tenuissima、引起铁皮石斛茎腐病的砖红镰孢菌Fusarium incarnatum或层出镰孢菌Fusarium proliferatum和引起铁皮石斛灰霉病的的灰葡萄孢菌Botrytis cinerea。并对上述病原菌的生物学特性及对部分杀菌剂的敏感性进行了测定，发现齐整小核菌代表菌株Sr1在pH4～8，25℃～30℃时适合生长;极细链格孢代表菌株At1在pH5～5.7，20℃～30℃时适合生长;砖红镰孢菌代表菌株Fi1和层出镰孢菌代表菌株Fp1均适合在pH＜7的偏酸性环境，25℃～30℃时生长;灰霉菌代表菌株Bc1更适合在pH＜7的偏酸性环境，20℃～25℃时生长。各病原菌代表菌株最适生长环境均与引起病害的发病规律相符。在测定碳、氮源培养基对病原菌影响实验中发现且不同碳源对菌株Sr1、菌株Fi1、菌株Fp1、菌株Bc1的生长差异均显著，菌株Sr1生长较好的碳源为甘露醇和淀粉，菌株Fi1生长较好的碳源为D-葡萄糖、蔗糖和甘露醇，菌株Fp1在生长较好的碳源为甘露醇和L-阿拉伯糖，菌株Bc1生长较好的碳源为D-果糖和D-葡萄糖。而不同氮源处理对上述四种菌株(Sr1，Fi1，Fp1，Bc1)的生长影响均不显著。而菌株At1在供试碳、氮源处理中均能很好的生长，生长差异不显著，说明该菌株具有良好的生长适应能力。杀菌剂敏感性测定实验表明木霉菌素、雷帕霉素、戊唑醇和异菌脲可选作白绢病的防治药剂。咪鲜胺和异菌脲可选作黑斑病的防治药剂。咪鲜胺可选作铁皮石斛茎腐病的防治药剂，雷帕霉素对铁皮石斛茎腐病具有一定防治效果，另外戊唑醇可用于防治由层出镰孢菌造成的铁皮石斛茎腐病。雷帕霉素、咪鲜胺和异菌脲可选作铁皮石斛灰霉病的防治药剂。另外木霉菌素对灰霉病菌的防效也较显著。雷帕霉素和木霉菌素均为生物源农药，所以在铁皮石斛的病害防治中可以优先使用。
　　(2)通过对实验室铁皮石斛组培苗以及田间实生苗的测定，发现印度梨形孢对铁皮石斛的生长具有明显的促进作用。实验室内铁皮石斛组培苗接种印度梨形孢60天后，接菌苗分蘖多，与接种前比较，平均侧芽增加数为6.2，而对照组平均侧芽只增加了2.1，说明印度梨形孢有促进铁皮石斛芽分化的作用。且接种组茎秆翠绿，叶片幼嫩而新鲜，生长势明显较对照组好，鲜重增长率达到109.43％，高出对照组18％。初步的实验结果表明，印度梨形孢既可以增加铁皮石斛的生长量，还有助于促进铁皮石斛侧芽的萌发与生长。另外，在了解印度梨形孢生活史的基础上，采用多种细胞壁降解酶对印度梨形孢孢壁进行裂解，最后获得了用溶壁酶高效裂解印度梨形孢孢子的方法，成功制备了印度梨形孢原生质体，浓度可达7.55×107～17.71×107个/ml，为今后印度梨形孢的遗传转化体系建立、印度梨形孢在铁皮石斛根部的定殖观察及其分子生物学的研究奠定了基础。

目录

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论文说明

致谢

摘要

第一章 文献综述

1 铁皮石斛研究进展

1．1 铁皮石斛在我国分布情况及药用价值

1．2 浙江省铁皮石斛产业发展

1．3 铁皮石斛病害研究概况

1．4 内生真菌对铁皮石斛的作用

2 印度梨形孢研究进展

2．1 印度梨形孢的寄主范围

2．2 印度梨形孢生物学效应

3 研究目的、意义及内容

3．1 研究目的与意义

3．2 主要研究内容

第二章 材料与方法

1 供试材料

1．1 供试植物及菌株

1．2 供试菌株

1．3 试剂

1．4 培养基

1．5 缓冲液

2 实验操作

2．1 铁皮石斛病害病原茵分离、纯化与鉴定

2．2 铁皮石斛分离病原菌生物学特性研究

2．3 五种杀菌剂对铁皮石斛病原菌的室内毒力测定

2．4 DNA和RNA的操作

2．5 印度梨形孢对铁皮石斜的促生作用

2．6 印度梨形孢转化体系探索

第三章 结果与分析

1 铁皮石斛真菌病害分离、鉴定与生物学特性测定

1．1 病害分离结果

1．2 分离物致病性测定

1．3 病原菌的形态学特征

1．4 病原菌的分子水平鉴定结果

1．5 不同病原菌的生物学特性测定

1．6 不同药剂对病原菌的毒力测定

2 印度梨形孢对铁皮石斛的促生作用

2．1 印度梨形孢对铁皮石斛的促生现象

2．2 印度梨形孢转化体系探索

第四章 全文总结讨论及展望

1 全文总结与讨论

1．1 铁皮石斛真菌病害调查与分离鉴定

1．2 印度梨形孢促生作用

2 展望

2．1 铁皮石斛病害防治研究

2．2 P．indica等微生物菌剂的研究

参考文献