细粒棘球蚴胶体金免疫层析快速检测试纸条的研制与初步应用

摘要

细粒棘球蚴病，或称囊型包虫病，是由细粒棘球蚴（Echinococcus granulosusis）所引起的一种人畜共患性寄生虫病。在我国感染细粒棘球蚴的动物当中，羊的感染情况最严重。但临床应用中，对细粒棘球蚴病的不同诊断方法，依然存在各自的缺陷。因此，本研究的目的在于建立一种快速、简便、准确的利于基层诊断的羊细粒棘球蚴检测方法。
　　本研究对细粒棘球蚴HSP70(Heat shock protein70)蛋白进行了克隆及原核表达，根据GenBank中的细粒棘球蚴hsp70基因序列，用Primer5软件设计了特异性引物，以细粒棘球蚴基因组为模板，扩增hsp70片段，将该基因片段克隆至pMD18-T Vector并至感受态大肠杆菌TOP10，再用PCR及酶切鉴定。经过测序鉴定，得到了大小为957bp的目的片段，与GenBank中的序列相比，两者相似性为99.4％。然后将该片段和表达载体pET30a分别用EcoRⅠ和HindⅢ进行双酶切鉴定，构建了表达载体pET30a-hsp70，将其转化至大肠杆菌BL21，用IPTG诱导表达，表达产物经过SDS-PAGE分析显示，细粒棘球蚴HSP70的原核表达成功，蛋白约为43 kDa。接着用纯化蛋白免疫新西兰雄性白兔，第二、第三次免疫后一周采血、析出血清，并进行抗体效价测定，判断免疫效果;第四次免疫后一周大量采血、析出血清，进行抗体效价及特异性检测，最终获得效价为＞1∶51200的多抗。同时，本研究制备了直径约为15nm的胶体金颗粒，以胶体金标记HSP70，制备胶体金试纸条，建立了一种细粒棘球蚴的快速检测方法。该方法可在20 min内得到检测结果，400～500倍稀释待检血清得到的显色条带最明显，并且在阳性羊血清稀释到1000倍依旧可以观察到阳性条带，与感染肝片吸虫、捻转血矛线虫、小反刍兽疫、口蹄疫的羊阳性血清不发生交叉反应，且试纸条在4℃保存8个月后依然具有较高的检测效果。本研究中采集了来自浙江省杭州、温州、丽水、舟山、台州、衢州、金华、湖州、嘉兴、绍兴、宁波11个地区养殖场的728份羊血清样品，并应用建立的胶体金免疫层析检测方法对血清样品进行检测，发现样品中呈阳性的有19份，浙江省这11个地区的总检测阳性率为2.61％。对羊血清样品的检测数据进行统计学分析，结果显示浙江省部分地区羊的细粒棘球蚴感染明显少于西北地区，提示在浙江省地区对该病的防治工作做得相对较好。
　　综上所述，本研究基于细粒棘球蚴hsp70基因建立了一种可靠的胶体金试纸条检测方法，运用该方法对浙江省11个地区养殖场的羊血清样本进行检测，并对试验数据进行统计学分析。初步应用结果说明，该试纸条具有良好的应用前景。

目录

声明

论文说明

摘要

英文缩略词表

前言

第一章 文献综述

1 细粒棘球蚴与细粒棘球蚴病

1．1 病原学及形态特征

1．2 生活史

1．3 流行病学

1．4 致病性及I艋床症状

1．5 临床诊断

1．6 防治

2 细粒棘球蚴病诊断研究进展

2．1 概述

2．2 病原学检测

2．3 分子生物学检测

2．4 血清学检测

2．5 影像学检查

3 胶体金免疫层析试纸条检测技术的简介

3．1 技术原理

3．2 试纸条的使用方法

3．3 试纸条的展望

4 小结

第二章 细粒棘球蚴HSP70蛋白的原核表达及其多克隆抗体制备

1 引言

2 材料与方法

2．1 参考虫株、血清与实验动物

2．2 主要试剂与仪器

2．3 总RNA的提取及cDNA的合成

2．4 引物的设计与合成

2．5 hsp70基因的RT-PCR扩增

2．6 PCR产物的克隆、鉴定

2．7 pET 30a-hs70质粒的构建

2．8 重组蛋白的诱导表达

2．9 重组蛋白的SDS-PAGE分析及Western blot鉴定

2．10 HSP70的大量制备与纯化、复性

2．11 抗HSP70多克隆抗体的制备

2．12 间接ELISA检测抗体水平

2．13 多克隆抗体的Western blot鉴定

3 结果

3．1 PCR扩增结果

3．2 重组质粒pET 30a-hsp70的鉴定

3．3 重组蛋白的SDS．PAGE分析及Western blot鉴定

3．4 表达产物的定性分析

3．5 重组蛋白的纯化

3．6 多克隆抗体效价的测定

3．7 多克隆抗体的Western blot分析

4 讨论

第三章 细粒棘球蚴胶体金免疫层析检测试纸条的研制

1 引言

2 材料与方法

2．1 材料

2．2 胶体金颗粒的烧制

2．3 制备金标重组蛋白

2．4 试纸条的制备

2．5 检测步骤

2．6 试纸条的交叉反应测试

2．7 试纸条的检测效价测试

2．8 试纸条的稳定性测试

2．9 试纸条的批间差试验

3 结果

3．1 胶体金颗粒的形态

3．2 金标蛋白的最佳条件

3．3 试纸条的初步测试

3．4 试纸条的交叉反应试验

3．5 试纸条的检测效价试验

3．6 试纸条的稳定性

3．7 试纸条的批间差试验

4 讨论

第四章 细粒棘球蚴胶体金免疫层析试纸条的初步应用

1 引言

2 材料与方法

2．1 样品采集

2．2 主要试剂及仪器

2．3 试纸条的阳性符合事试验

2．4 试纸条的阴性符合率试验

2．5 浙江省内羊细粒棘球蚴病的流行病学调查

2．6 数据分析

3 结果

3．1 试纸条的阳性符合率试验

3．2 试纸条的阴性符合事试验

3．3 浙江省内各地区羊细粒棘球蚴病的流行病学调查结果

4 讨论

全文小结

参考文献

附录

致谢

攻读硕士学位期间的主要成果