拟穴青蟹谷氨酸脱氢酶基因的全长cDNA克隆及低渗下的表达分析

摘要

拟穴青蟹(Scylla paramamosain)是我国东南沿海主要的海水养殖蟹类之一，具有重要的经济价值与食用价值。但随着环境条件的日益恶化和集约化养殖的发展，由养殖水体环境低渗胁迫引起拟穴青蟹渗透失衡而导致养殖拟穴青蟹疾病频发。谷氨酸脱氢酶（Glutamate dehydrogenase，GDH）是调节脯氨酸、甘氨酸和丙氨酸代谢的关键酶之一。此三种游离氨基酸是常见的渗透效应物，在甲壳动物渗透调节中起重要作用。而有关GDH基因在甲壳动物中的研究并不多见。本实验采用同源克隆策略和RACE技术在拟穴青蟹鳃上成功克隆得到GDH基因的全长cDNA序列，并分析GDH基因核苷酸序列、氨基酸序列结构及其在拟穴青蟹不同组织中的表达情况。同时研究拟穴青蟹在不同低渗处理下其肌肉中GDH基因表达量与游离氨基酸的变化情况，探究GDH基因与甲壳动物渗透调节的关系及其调控机制。
　　拟穴青蟹GDH基因全长为2269 bp，包括1662 bp的ORF，编码由533个氨基酸组成的蛋白质，5' UTR（5'端非编码区）为37 bp，3'UTR（3'端非编码区）为570 bp，GenBank的登录号为KM189809。生物信息学分析表明拟穴青蟹GDH基因具有一段由17个氨基酸残基构成的信号肽序列。与其他物种GDH基因氨基酸序列进行同源性分析比较，结果显示拟穴青蟹GDH基因与中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis）GDH基因同源性最高(93％)，其后依次为凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)GDHb基因(92％)，中华对虾（Fenneropenaeus chinensis）GDH基因(91％)，凡纳滨对虾GDHa基因(89％)。聚类分析表明，拟穴青蟹GDH基因氨基酸序列与中华绒螯蟹密聚为一支，又与凡纳滨对虾及中国对虾组成的一支聚成一个小支。
　　经实时荧光定量PCR检测，拟穴青蟹GDH基因在血细胞、肌肉、肠、触角腺、肝胰腺、心脏和鳃这7个组织中均有表达，且表达量不同。其中GDH基因在拟穴青蟹的肌肉中表达量最高，其次为肝胰腺与鳃，在血细胞中表达量最低。
　　环境盐度从28骤降至5的实验结果表明，血淋巴渗透压在6h急剧下降至最低值;GDH基因表达量急剧下降，同样在6h到达最低值为初始值的29.6％;肌肉中总游离氨基酸含量显著下降，其中包括谷氨酸、甘氨酸和谷氨酰胺的含量，而丝氨酸含量显著上升。血淋巴中总游离氨基酸含量显著升高，与GDH基因表达结果呈相反趋势，对环境低渗胁迫而引起的血淋巴渗透压骤降起到缓冲作用。
　　不同盐度低渗胁迫实验结果表明，环境盐度从28（对照组）分别骤降至21、14和5后24 h，拟穴青蟹血淋巴渗透压随环境盐度下降而下降，而GDH基因表达量无显著差别。与对照组相较，水体环境盐度降至21、14和5后，拟穴青蟹肌肉中总游离氨基酸含量均显著下降，主要包括精氨酸、脯氨酸、谷氨酸和脯氨酰胺等。
　　实验结果显示，GDH基因通过调节游离氨基酸代谢，参与拟穴青蟹低渗胁迫下的渗透调节过程。实验结果为进一步探究GDH基因在甲壳动物渗透调节中的作用及其调控机制奠定基础。

目录

声明

摘要

缩略词表

1 文献综述

1．1 拟穴青蟹生物学特性

1．1．1 分类地位

1．1．2 地理分布

1．1．3 生活习性

1．1．4 蜕壳与生长

1．1．5 繁殖习性

1．2 甲壳动物渗透研究进展

1．2．1 非等渗细胞外调节

1．2．2 等渗细胞内调节

1．3 本项目研究目的与意义

2 实验材料

2．1 实验材料及仪器设备

2．1．1 实验材料及处理

2．1．2 主要化学试剂

2．1．3 主要仪器设备

2．1．4 主要试剂配制

2．2 实验方法

2．2．1 目的基因片段获得

2．2．2 RACE-PCR获得基因全长

2．2．3 基因序列分析

2．2．4 血淋巴渗透压测定

2．2．5 实时荧光定量PCR

2．2．6 游离氨基酸测定

2．2．7 数据分析

3 实验结果

3．1 GDH基因的克隆与序列分析

3．2 血淋巴渗透压测定

3．3 GDH基因组织表达

3．4 低渗下GDH基因表达

3．5 肌肉和血淋巴中游离氨基酸含量测定

4 讨论

4．1 GDH基因序列及结构

4．2 血淋巴渗透压

4．3 GDH基因表达

4．4 肌肉和血淋巴中游离氨基酸含量

5．小结

参考文献

已发表论文

致谢