华支睾吸虫PCR及间接ELISA检测方法的建立

摘要

华支睾吸虫病是由华支睾吸虫（Clonorchis sinensis）引起的一种人畜共患寄生虫病。华支睾吸虫病在我国流行极为广泛，约有1500多万感染者。由于华支睾吸虫寄生在人或动物肝脏胆管和胆囊内，患者或患畜因虫体对胆管的机械性损伤和阻塞及虫体分泌排泄物的刺激作用而引起胆管及其周围炎症，进而导致肝实质萎缩、硬化、功能障碍及其他全身性症状。华支睾吸虫虫卵还可以引起结石，胆管上皮细胞增生可致癌变。华支睾吸虫的感染不仅给人类健康带来了造成威胁，也危害养殖业的健康发展，给养殖业造成较大经济损。面对严峻的形势，急需一种简便快捷的快速诊断方法，可以对患者患畜尽早确诊，对检出的阳性患畜或者水产品也可以尽早采取切实有效的治疗措施，降低损失。
　　1.基于nad2基因华支睾吸虫PCR检测方法的建立
　　本研究基于华支睾吸虫线粒体DNA NADH脱氢酶亚基2基因(nad2)序列，设计合成一对特异性引物，建立了检测华支睾吸虫的普通PCR方法。实验证明，该方法特异性较好，用姜片吸虫、蛔虫、隐孢子虫、球虫、大肠杆菌为模板均不能扩增出任何条带;敏感性高，可检测到的华支睾吸虫DNA最低量为186 fg/μL。
　　2.基于nad2基因华支睾吸虫Real-time PCR检测方法的建立
　　本研究基于华支睾吸虫的nad2基因序列，设计了特异性的引物，经过Real-time PCR扩增和对扩增体系及条件的优化，采用SYBR@Green荧光染料法建立华支睾吸虫的Real-time PCR检测方法。本研究使用含有nad2基因的重组质粒pMD-nad2作为标准品绘制标准曲线，其相关系数为0.998。实验结果表明，本方法特异性好，与姜片吸虫、蛔虫、隐孢子虫、球虫、大肠杆菌等病原体的DNA均无交叉反应;敏感性实验结果表明，最低可检测到的华支睾吸虫DNA量为0.15 fg/μl，比普通PCR检测方法的敏感性高了1000倍左右。用建立起来的两种PCR方法对采集的202份粪样DNA进行检测，PCR检测方法检出阳性样本1份，阳性率为0.49％。用Real-time PCR检测方法检出阳性样本2份，阳性率为0.99％。相比之下，Real-time PCR比普通PCR检测方法表现出更高的灵敏度。
　　3.基于重组蛋白enolase华支睾吸虫间接ELISA检测方法的建立
　　本研究以华支睾吸虫烯醇酶(enolase)重组蛋白为包被抗原，建立检测华支睾吸虫的间接ELISA方法。通过对反应体系的优化，结果表明，ELISA最佳工作条件为:抗原最佳包被质量浓度为5 mg//L，37℃1 h再4℃过夜;5％脱脂奶粉，37℃封闭1 h;待检血清1∶100稀释37℃孵育1 h;酶标二抗1∶5000稀释，37℃孵育45 min; TMB显色作用时间10 min;确定的阴阳性血清临界值为0.253。所建立的ELISA方法特异性较好，可检测犬华支睾吸虫病阳性血清，与犬卫氏并殖吸虫病阳性血清、犬蛔虫病阳性血清、犬弓形虫病阳性血清、犬新孢子虫病阳性血清均不发生反应。该方法敏感性为1∶3200。重复性试验中，批间批内实验变异系数均小于10％。在临床初步应用中，对浙江地区353多份犬血清的检测表明，样品阳性率为1.13％。
　　综上所述，本研究基于nad2基因建立的PCR检测方法和Real-time PCR检测方法特异性、敏感性都较好，在分子水平上为华支睾吸虫病的临床诊断和流行病学调查提供了有效的途径;建立的间接ELISA方法可以用于临床病例的血清学检测，为华支睾吸虫的血清学流行病学调查提供了有效手段。

目录

声明

论文说明

摘要

英文缩略词表

前言

第一章 文献综述

1 华支睾吸虫及华支睾吸虫病概况

1．1 华支睾吸虫病原形态

1．2 华支睾吸虫生活史

1．3 华支睾吸虫的流行病学

1．4 华支睾吸虫病的病理变化

1．5 免疫学

1．6 华支睾吸虫病的临床症状

1．7 临床诊断

1．8 疫苗

1．9 华支睾吸虫病的化学治疗和预防控制

2 华支睾吸虫检测技术研究进展

2．1 临床诊断

2．2 病原学检测

2．3 免疫学检测

2．4 分子生物学检测

3 小结

第二章 华支睾吸虫PCR检测方法的建立

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 方法

2 结果

2．1 PCR扩增结果

2．2 测序结果分析

2．3 PCR反应条件的优化

2．4 PCR特异性试验结果

2．5 PCR敏感性试验结果

3 讨论

第三章 华支睾吸虫Real-time PCR检测方法的建立

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 方法

2 结果

2．1 阳性质粒pMD-nad2的构建

2．2 Real-time PCR扩增产物的鉴定

2．3 Real-time PCR标准曲线的建立

2．4 Real-time PCR特异性实验结果

2．5 Real-time PCR敏感性实验结果

2．6 Real-time PCR重复性实验结果

2．7 临床样品的检测

3 讨论

第四章 基于enolase基因华支睾吸虫间接ELISA检测方法的建立

1 材料和方法

1．1 材料

1．2 方法

2 结果

2．1 enolase基因原核表达与鉴定

2．2 间接ELISA方法的建立

2．3 间接ELISA临界值的确定

2．4 间接ELISA检测方法性能评价的结果

2．5 临床样品检测

3 讨论

全文小结

参考文献

附录

致谢

攻读硕士学位期间的主要成果