劳森氏胞内菌的PCR检测方法及其抗体间接ELISA检测方法的建立与应用

摘要

猪增生性肠炎(porcine proliferative enteritis，PE)是由劳森氏胞内菌（lawsoniaintracellularis，LI）引起的一种传染性肠道疾病，主要感染回肠，影响猪生长发育、饲料转化率等。劳森氏胞内菌是一种弯曲或直的弧状杆菌，末端渐细或钝圆，长1.25-1.75μm，宽0.25-0.43μm。此菌是一种典型的具有三层外膜的革兰氏阴性菌，没有发现纤毛和孢子。严格胞内寄生，因其特殊的培养条件，目前世界上分离到的菌株十分有限。目前国内对其临床感染情况的相关研究报道还很少，因此有必要对其进行进一步研究。现将本文研究内容简述如下:
　　 1.劳森氏菌16SrDNA的PCR方法的建立与应用2011年3月至2012年4月，从江苏规模化猪场采集粪便100份，建立劳森氏胞内菌套式PCR方法进行鉴定。检测结果显示劳森氏胞内菌阳性12份，阳性率为12％，其中育肥猪阳性6份（20份）、保育猪阳性5份（20份）、后备猪阳性1份（20份）、妊娠猪和哺乳猪均为阴性，育肥猪、保育猪的阳性率分别为30％、25％，说明该病原主要感染发育阶段的猪，影响猪日增重及饲料转化率，从而可造成严重的经济损失，应当引起足够重视。
　　 2.劳森氏胞内菌外膜蛋白基因在大肠杆菌的高效表达及表达产物的纯化制备参考GenBank上已发表的劳森氏胞内菌外膜蛋白基因序列，设计引物进行扩增，并将该片段定向插入到原核表达载体pET-32a(+)中成功构建出原核表达载体，将其转化宿主菌BL21，经IPTG诱导，SDS-PAGE电泳分析初步确定重组的融合蛋白pET32α-1102能够进行表达35KDa的条带，表达产物经His-tag柱子纯化后进行Western blotting分析，初步确定融合蛋白pET32α-1102具有抗原性。研究结果验证劳森氏胞内菌外膜蛋白基因表达的蛋白具有抗原性，为诊断试剂盒及基因工程疫苗的研制提供了理论基础。
　　 3.猪劳森氏菌抗体间接ELISA方法的建立与应用以表达的外膜蛋白作为诊断抗原包被酶标板，建立了可检测劳森氏菌抗体的间接ELISA方法。经优化条件，最佳包被浓度为20 ng/mL，血清的最佳稀释倍数为1∶400，最佳反应时间为30分钟，酶标二抗的最佳工作稀释度为1∶15000，最佳作用时间为30分钟。92份猪血清样品分别用建立的间接ELISA和进口试剂盒进行平行检测，结果显示建立的间接ELISA方法与进口试剂盒的符合率达97.82％，其中阳性符合率为95.12％，阴性符合率为96.22％。血清学试验结果证实猪对劳森氏胞内菌产生的血清抗体反应是特异的，虽然采血比采集粪便较为费时，但是血清学试验比较便宜，而且更适合大量样本的检验。

目录

声明

摘要

符号说明

第一章 劳森氏胞内菌研究进展

1 前言

2 病原学

3 流行病学

4 临床症状

5 病理变化

6 致病机制

6．1 感染的早期事件—定植

6．2 对宿主细胞的附着

6．3 细胞入侵

6．4 对胞内液泡的逃避

6．5 细胞内增殖和细胞间传播

6．6 细胞增殖

6．7 免疫反应

6．8 细胞内细菌的持续存在

6．9 感染细胞的传播和转移性扩散

7 检测诊断方法

8 治疗与预防

参考文献

第二章 劳森氏菌16SrDNA的PCR检测方法的建立与应用

1 材料和方法

1．1 毒株及被检样本

1．2 试剂和仪器

1．3 引物设计

1．4 细菌核酸的提取

1．5 检测劳森氏菌套式PCR的建立

1．6 反应体系特异性实验

1．7 反应体系敏感性实验

1．8 PCR产物的检测

1．9 序列分析

1．10 PCR体系临床应用

2 结果与分析

2．1 PCR反应体系各成分含量优化结果及PCR反应体系的确定

2．2 反应体系特异性试验

2．3 反应体系敏感性试验

2．4 PCR产物测序与分析

2．5 样本检测

3 讨论与分析

第三章 劳森氏菌外膜蛋白基因在大肠杆菌的高效表达及表达产物的纯化制备

1 材料与方法

1．1 菌株及表达载体

1．2 实验动物及血清

1．3 实验试剂和仪器

1．4 引物合成

1．5 PCR扩增

1．6 琼脂糖凝胶电泳

1．7 DNA片段的纯化回收

1．8 T-1102载体构建

1．9 载体DNA和目的基因的酶切、回收、连接

1．10 细菌转化

1．11 酶切鉴定

1．12 诱导表达

1．13 Western blotting

1．14 表达蛋白的纯化

1．15 抗体制备

2 结果与分析

2．1 外膜蛋白基因的PCR扩增

2．2 PCR产物克隆到pMD-18T载体的构建

2．3 重组表达载体Pet32-1102的构建

2．4 重组载体的诱导表达及纯化

2．5 表达产物的Western blot鉴定

3 讨论

第四章 猪劳森氏菌抗体间接ELISA的建立与应用

1 材料与方法

1．1 抗原制备

1．2 血清

1．3 主要试剂与仪器

1．4 抗原最佳包被浓度和待检血清稀释度的确定

1．5 封闭液的选择

1．6 一抗最佳反应时间的确定

1．7 二抗最佳浓度及反应时间的确定

1．8 底物最佳反应时间的确定

1．9 重复性实验

1．10 与进口试剂盒检测的数据比较

1．11 间接ELISA的临床应用

2 结果与分析

2．1 抗原最佳包被浓度及待检血清最佳稀释度的选择

2．2 封闭液的选择

2．3 血清作用时间确定

2．4 酶标抗体二抗作用浓度和作用时间的确定

2．5 底物最佳反应时间的确定

2．6 重复性实验

2．7 间接ELISA操作程序的确定

2．7 与进口试剂盒检测的数据比较

2．8 样本检测结果

3 讨论

参考文献

全文总结

致谢