杭白菊病毒病原鉴定及脱毒苗生物学性状与品质性状分析

摘要

杭白菊（Chrysanthemun morifolium Ramat.）是浙江省桐乡市的主要特产，是浙江省八大名药材“浙八味”之一，近年来由于病毒病爆发严重影响了杭白菊的产量和品质，为此本文着重展开了分离和鉴定危害桐乡市杭白菊的主要病毒病原，创制了杭白菊脱毒健康种苗，并分析了脱毒对杭白菊生物学性状及品质性状的影响。主要研究结果如下:
　　(1)调研了主产区桐乡市杭白菊专业合作社，发现几个重要种植基地病毒感染严重，病株的主要症状为叶片斑纹明显，花叶，分枝少，严重地块叶片呈褐色斑枯，植株枯死，致使菊花产量下降、品质变劣。
　　(2)综合运用病毒粒子形态、DAS-ELISA检测、RT-PCR检测及序列测定等技术进行病原菌鉴定，透射电镜下观察到病株汁液含600～700nm略微弯曲的杆状病毒粒子;应用菊花B病毒(CVB)抗体进行DAS-ELISA检测结果为阳性，对阳性结果进行分子水平检测发现CVB外壳蛋白编码序列长度为982bp，测序结果在NCBI中进行BLAST比对，发现与报道的编码菊花B病毒外壳蛋白的核苷酸序列(GenBank登录号:EU499736.1)相似度最高为92％，可确定扩增片段为菊花B病毒的外壳蛋白基因，明确了侵染浙江省桐乡杭白菊的病毒病原为CVB。
　　(3)采用“多步分步法”创制脱毒种苗，建立了杭白菊脱毒健康种苗的快速繁殖体系，外植体最佳的消毒处理为75％乙醇30s，0.1％氯化汞12min，成活率为70％;最适宜茎段生长壮苗的培养基为MS+0.1mg/L6-BA+0.1mg/LNAA，最佳生根培养基为1/2MS+0.1mg/LNAA，生根率为100％;待植株株高为5～6cm，根数为3～5条，根长约1cm时移栽到温室内生长，成活率可达100％。在解剖镜下剥取0.3～0.5mm无菌苗茎尖，接种到培养基中进行茎尖苗的诱导，茎尖成活率约10％，经透射电镜、RT-PCR及DAS-ELISA等方法检测，获得12％脱除CVB的杭白菊苗。经田间的推广示范发现脱毒种苗在分枝数、有效花朵数、叶绿素相对含量参数方面与常规杭白菊有显著性差异，脱毒‘早小洋菊’的亩产量达490.1kg，脱毒‘小洋菊’的亩产量达1083.3kg，分别增产11％、29％。脱毒‘早小洋菊’、脱毒‘小洋菊’中总黄酮的含量分别为70.41mg/g，63.94mg/g，常规苗中含量分别为53.44mg/g，43.41mg/g;脱毒‘早小洋菊’、脱毒‘小洋菊’中绿原酸含量分别为2.71mg/g、2.13mg/g，常规苗中含量分别为1.62mg/g，1.01mg/g，脱毒苗中绿原酸含量高于药典中规定的0.2％。

目录

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声明

致谢

摘要

第1章 引言

1．1 杭白菊生物学特性

1．1．1 杭白菊形态特征

1．1．2 杭白菊主要功效成分

1．2 杭白菊的加工、保存以及分级标准

1．2．1 杭白菊采摘及加工

1．2．2 杭白菊分级标准

1．3 杭白菊主要病毒病概述

1．3．1 菊花B病毒

1．3．2 番茄不孕病毒

1．3．3 菊花矮化类病毒

1．3．4 烟草花叶病毒

1．4 植物病毒病检测方法

1．4．1 生物学检测方法

1．4．2 血清学技术

1．4．3 电子显微镜观察法

1．4．4 分子生物学检测

1．5 植物脱毒方法

1．5．1 茎尖组织培养脱毒法

1．5．2 热处理结合茎尖培养脱毒法

1．5．3 化学脱毒药剂

1．5．4 超低温保存结合茎尖培养脱毒法

1．6 杭白菊植物组织培养

1．7 本论文研究的目的及意义

第2章 桐乡市杭白菊主要病毒鉴定

2．1 材料与方法

2．1．1 试验材料

2．1．2 试验仪器及试剂

2．1．3 病毒粒子形态观察

2．1．4 RT-PCR法检测和序列分析

2．1．5 DAS-ELISA检测

2．2 结果与分析

2．2．1 病毒病田间调查

2．2．2 病毒粒子形态观察

2．2．3 DAS-ELISA检测杭白菊病毒病原

2．2．4 RT-PCR检测与序列测定

2．2．5 讨论

第3章 杭白菊脱毒苗创制、鉴定及快繁体系建立

3．1 材料与方法

3．1．1 试验材料

3．1．2 试验设备与试剂

3．1．3 杭白菊无菌苗培养

3．1．4 无菌苗生长壮苗

3．1．5 杭白菊生根诱导

3．1．6 脱毒苗的创制及脱毒鉴定

3．1．7 杭白菊脱毒苗快繁

3．2 结果与分析

3．2．1 不同消毒处理对杭白菊外植体存活的影响

3．2．2 不同激素浓度对茎段生长的影响

3．2．3 不同激素浓度对生根的影响

3．2，4 茎尖剖离对脱毒的影响

3．2．5 杭白菊脱毒苗扩繁

第4章 杭白菊田间农艺性状表现

4．1 试验材料与方法

4．1．1 试验材料及仪器

4．1．2 试验方法

4．2 试验结果与分析

4．2．1 脱毒对杭白菊株高和茎粗的影响

4．2．2 脱毒对杭白菊花瓣特征的影响

4．2．3 脱毒对杭白菊叶绿素的影响

第5章 杭白菊总黄酮和绿原酸含量测定

5．1 试验材料与方法

5．1．1 试验材料与试剂

5．1．2 试验设备

5．1．3 杭白菊干花粉末的制备

5．1．4 总黄酮含量测定

5．1．5 绿原酸含量测定

5．2 试验结果与分析

5．2．1 脱毒对杭白菊总黄酮含量的影响

5．2．2 脱毒对杭白菊绿原酸含量的影响

第6章 结论及讨论

参考文献

附录

附件

作者简历