MAPK信号通路在MED烟粉虱应对外界环境压力时的作用

摘要

烟粉虱Bemisia tabaci是热带及亚热带地区重要的农业害虫。随着MiddleEast-Asia Minor1(MEAM1)和Mediterranean(MED)两种外来烟粉虱的入侵，烟粉虱在我国各地区迅速成灾，给农业生产带来了巨大危害。烟粉虱不仅能够吸食植物汁液造成植物营养不良，还能够传播病毒，其中大部分是双生病毒。入侵型烟粉虱能够较好的适应各种环境，包括不适宜的寄主植物、极端温度、病原真菌、细菌侵染等。然而，这种适应性的分子机制还不甚明了。丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen activated protein kinase，MAPK)信号通路途径高度保守，参与控制生物体一系列的生理生化反应，特别是压力应对过程。本文主要克隆了入侵型MED烟粉虱体内MAPK的相关基因，并研究了不同环境压力下，烟粉虱体内MAPK基因的表达以及途径的激活情况，分析其可能存在的生物学功能。本文的主要研究结果如下:
　　(1)MED烟粉虱MAPK相关基因的克隆和分析本文克隆了MED烟粉虱体内MAPK的三个相关基因—JNK（c-Jun氨基末端激酶）、p38、ERK（细胞外信号调节蛋白激酶），并与其他物种进行了比较。结果显示，MED烟粉虱JNK包含一个1176 bp的开放阅读框(ORF)，编码392个氨基酸。p38包含一个含有1077bp的ORF，编码359个氨基酸。而ERK编码的362个氨基酸构成一个大小为41.71KDa的蛋白。对三者的氨基酸序列分析表明，MAPK高度保守，并拥有保守的双磷酸化基团(JNK∶TPY; p38∶TGY;ERK∶TEY)。
　　(2)不同温度对MAPK信号途径的影响为了探究不同温度对烟粉虱MAPK途径的影响，设置了0-40℃共六个温度点。用p-JNK（磷酸化JNK），p-p38（磷酸化p38），p-ERK（磷酸化ERK）抗体进行检测，结果表明，低温条件下，p38磷酸化蛋白增多，说明对应的信号通路途经被激活，而JNK和ERK磷酸化蛋白量无明显变化。由此推测，p38可能与烟粉虱低温压力下的应激反应有关。为了进一步探究低温条件下MED烟粉虱体内p38途径的变化情况，继续将烟粉虱放置于0℃条件下，经过不同时间点后收虫。结果表明，第三分钟时即可检测到磷酸化p38蛋白，说明p38信号通路途经在0℃被迅速激活。
　　(3)寄主转换对MAPK信号途径的影响将MED烟粉虱成虫从健康棉花（适宜寄主）转移至健康烟草（不适宜寄主）上，以健康棉花作为对照。结果表明ERK基因相对表达量大幅度下降，JNK和p38则无较大变化。而Western blot结果显示，烟粉虱体内磷酸化p38、ERK、JNK蛋白均无明显变化。说明寄主转换并未激活烟粉虱体内MAPK信号途径。
　　(4)真菌及细菌对MAPK信号途径的影响为了验证MAPK信号途径在烟粉虱免疫过程中所起的作用，利用真菌（白僵菌）和细菌（假单胞杆菌）侵染MED烟粉虱。以Tween20作为对照，结果表明，细菌处理条件下，MAPK基因、蛋白表达量均无明显变化，说明MAPK信号通路与烟粉虱对抗细菌侵染无较大关联。而真菌却能够激活烟粉虱体内的JNK途径。结果显示，真菌侵染烟粉虱后，其体内磷酸化的JNK明显增多，p38、ERK无较大变化，说明JNK在烟粉虱应对真菌侵染的免疫反应中起着重要的作用。
　　综上所述，MAPK信号通路途径参与了MED烟粉虱对不良环境的对抗。寄主转移和细菌侵染与MAPK信号途径无直接关系。而低温及真菌侵染则能激活烟粉虱体内的MAPK信号途径。其中，低温特异性激活p38途径，而真菌侵染则激活JNK途径。这些结果均表明，MAPK信号途经在烟粉虱对环境的适应过程中起着重要作用。

目录

声明

论文说明

致谢

摘要

1 文献综述及本研究的目的意义

1．1 烟粉虱

1．1．1 烟粉虱起源与分布

1．1．2 烟粉虱的发生和危害

1．2 不同条件对烟粉虱生物学特性的影响

1．2．1 温度

1．2．2 寄主植物

1．2．3 真菌，细菌

1．3 Mitogen-activated protein kinases(MAPKs)

1．3．1 MAPK概述

1．3．2 MAPK途径在昆虫研究中进展

1．4 本研究的主要内容、目的和意义

1．4．1 本研究的目的和意义

1．4．2 本研究的主要内容

2 基本材料和方法

2．1 供试昆虫

2．2 供试植物

2．3 生态学相关主要仪器设备

2．4 生化及分子生物学研究相关的主要仪器和化学试剂

2．4．1 主要仪器

2．4．2 主要化学试剂

2．5 常用基本方法

2．5．1 烟粉虱基因组DNA提取方法

2．5．2 烟粉虱RNA以及cDNA提取方法

2．5．3 qRT-PCR

2．6 烟粉虱蛋白粗提法

2．7 Western blot

2．8 数据处理方法

3 MED烟粉虱JNK、p38和ERK基因的克隆

3．1 材料和方法

3．1．1 供试昆虫和植物

3．1．2 主要试剂

3．1．3 MED烟粉虱JNK、p38以及ERK基因的克隆

3．1．4 基因序列及同源性分析方法

3．2 结果和分析

3．2．1 JNK、p38以及ERK基因全长序列

3．2．2 JNK、p38以及ERK基因序列及同源性分析

3．3 讨论

4 MED烟粉虱JNK、p38、ERK基因功能研究

4．1 材料和方法

4．1．1 供试昆虫和植物

4．1．2 主要试剂

4．1．3 不同发育历期烟粉虱的收集

4．1．4 温度处理方法

4．1．5 寄主转换处理方法

4．1．6 细菌处理方法

4．1．7 真菌处理方法

4．2 结果和分析

4．2．1 MED烟粉虱不同发育阶段MAPK基因的表达情况

4．2．2 不同温度处理对MED烟粉虱MAPK途径的影响

4．2．3 0℃处理不同时间对MED烟粉虱p38途径的影响

4．2．4 不同寄主对MED烟粉虱MAPK途径的影响

4．2．5 Pseudomonas aeruginosa处理对MED烟粉虱MAPK途径的影响

4．2．6 Beauveria bassiana处理对MED烟粉虱MAPK途径的影响

4．3 讨论

5 总讨论

5．1 MED烟粉虱JNK、p38和ERK基因的克隆

5．2 MEAM1烟粉虱JNK、p38和ERK基因相关功能研究

5．3 特色与创新

5．4 值得继续研究的问题

参考文献

作者简介