结直肠癌中甲基化、羟甲基化差异基因探索及KIAA1199、AQP8、SOX9、BEST4、MAL和ADH1A基因的预后分析

摘要

表观遗传可以改变基因转录水平，但不会改变DNA序列。近些年，越来越多的科学家投入到5-羟甲基胞嘧啶（5-hydroxymethylcytosine，5hmC）的研究中来。短短数年间，难以计数的文章报导了5hmC的化学结构、分布，功能以及与疾病的潜在关联。5hmC的出现拓宽了我们对表观调控的领域的认识，也为我们寻找结直肠癌相关基因提供新的线索。
　　在本研究中，我们运用甲基化免疫共沉淀测序(DNA immunoprecipitationsequencing，MedIP-seq)和羟甲基化免疫共沉淀测序(Hydroxymethylafion DNAimmunoprecipitafion sequencing，hMeDIP-seq)，在6对结直肠癌样本中，同步检测了5mC和5hmC的变化，并运用高通量RNA深度测序（High-throughputsequencing，RNA-seq），探索5mC、5hmC与转录水平之间的关系。之后，我们根据测序结果，选取了甲基化，羟甲基化和表达都有差异的候选基因，在135对结直肠癌样本中，进行mRNA水平的检测，并收集临床病理资料与随访信息，分析候选基因转录水平与临床病理参数以及预后之间的关系。
　　我们的结果显示，5mC和5hmC总体含量在结直肠癌肿瘤组织比在配对癌旁组织中低。但是，在DNA的一些局部区域，例如外显子，CpG岛以及短散在重复序列中，5mC含量是升高的。而5hmC含量在CpG岛岸、外显子以及转录起始位点附近丢失幅度很大。根据肿瘤组织与癌旁组织间5mC、5hmC的分布状况，我们发现了一些甲基化差异区段(differentially methylated region，DMR)和羟甲基化差异区段(differentially hydroxymethylated region，DhMR)。DMR和DhMR的分布具有一致性，在基因内部，内含子、基因间隔以及重复序列中富集。肿瘤组织中，甲基化上升区段主要在CpG岛和CpG岛岸，而下降区段主要在重复序列中。羟甲基化上升区段主要在启动子的CpG位点，而在CpG岛岸、增强子和外显子中丢失。根据DMR、DhMR分布差异，以及RNA-seq的结果，我们筛选到一批在肿瘤与癌旁组织中，存在甲基化羟甲基化与mRNA表达差异的基因，并在135例结直肠癌患者的肿瘤与配对癌旁组织中检测mRNA的表达水平，我们发现KIAA1199(0.112 vs.0.020)、SOX9(0.151vs.0.083)在肿瘤组织中表达上升，而AQP8(0.005 vs.0.238)、BEST4(0.004 vs.0.282)、MAL(0.014 vs.0.194)和ADH1A(0.045 vs.0.713)在肿瘤组织中表达下降，结果具有统计学意义（中位表达水平;肿瘤组织vs.配对癌旁组织;P＜0.05）。我们进一步分析这些基因转录水平和临床病理资料之间的关联，发现，KIAA1199表达在大于60岁的人群中较高（0.13 vs.0.10; P=0.06），AQP8在Duke's分期C和D期的患者中比A和B期表达高(0.003 vs.0.008; P＜0.05),BEST4(0.005 vs.0.003;P=0.06),MAL(0.012vs.0.007，P＜0.05)和ADH1A(0.071 vs.0.021;P＜0.05)均与肿块大小相关，在直径小于5cm的肿块组织中表达较低。其余包括TNM分期，组织学类型、分化、浸润、淋巴结转移等临床病理指标，均为得到统计学意义上的差异（P＞0.05;Kruskal-Wallis检验）。运用Kaplan-Meier生存分析后，发现这些基因的mRNA表达变化与患者预后存在关联，肿瘤组织中，高表达这些基因的人群，预后较差，结果具有统计学意义，其中，KIAA1199(P=0.027)、SOX9(P=0.043)、AQP8(P=0.033)、BEST4(P=0.004)、MAL(P=0.045)和ADH1A(P=0.001)。
　　总结而言，本研究发现结直肠癌中存在甲基化和羟甲基化修饰的改变，包括全基因组水平与DNA特定区域。我们找到了6个肿瘤中异常表达，并且与预后相关的基因，它们可以作为新的潜在分子靶标，对结直肠癌患者的治疗以及预后管理，提供一定程度上的帮助。

目录

声明

致谢

摘要

缩略语

1 引言

2 仪器设备和试剂

2．1 仪器设备

2．2 主要生物化学试剂

3 材料和方法

4 实验结果

4．1 结直肠癌组织DNA序列各组件中5mC与5hmC在的分布检测

4．2 结直肠癌组织DNA序列中5mC、5hmC差异区段分析

4．3 甲基化DNA标准品的制备和检验与基因组DNA碎片化验证

4．4 结直肠癌肿瘤组织和配对癌旁组织中，5mC、5hmC含量存在差异的基因筛查

4．5 结直肠癌患者肿瘤组织和配对癌旁组织中mRNA表达水平差异基因的筛查与验证

4．6 临床病理参数的整理分析

4．7 KIAA1199、AQP8、SOX9、BEST4、MAL和ADH1A表达与临床病理参数的相关性分析

4．8 KIAA1199、AQP8、SOX9、BEST4、MAL和ADH1A的mRNA表达水平对结直肠癌患者的预后影响

5 讨论

6 结论

参考文献

综述 5-羟甲基胞嘧啶在体内的分布以及对基因转录能力的影响

作者简历及在读期间所取得科研成果