结直肠癌中Vimentin基因甲基化的分析及基因组羟甲基化水平探讨

摘要

[目的]
　　建立液相色谱串联质谱(liquid chromatography-tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)分析组织基因甲基化和基因组羟甲基化水平方法，用于分析结直肠癌患者肿瘤组织和癌旁组织vimentin基因甲基化水平及基因组羟甲基化水平，寻找vimentin基因甲基化及基因组羟甲基化在肿瘤组织中的特点，探讨vimentin基因甲基化及基因组羟甲基化与肿瘤组织的联系，为研究基因甲基化及基因组羟甲基化相关的肿瘤诊断标志物提供科学依据。
　　[方法]
　　1.组织DNA提取:在组织中加入蛋白酶K，37℃过夜消化，然后用苯酚-氯仿法除去蛋白，最后加入乙醇把DNA沉淀下来，用紫外分光光度计进行DNA浓度以及纯度的检测。
　　2.Vimentin基因甲基化的LC-MS/MS分析:在NCBI网站上找到Vimentin基因序列，利用methprimer软件对Vimentin基因进行CpG岛分析，根据分析结果用Primer5.0软件对Vimentin exon1/2/3的CpG岛分别设计引物。
　　DNA样品经亚硫酸氢盐处理后，对Vimentin基因不同片段分别进行PCR扩增，所得扩增产物进行琼脂糖凝胶回收纯化，然后加入88％甲酸在140℃下反应90min，水解产物经固相萃取(solid phase extraction，SPE)纯化后氮气吹干，加入90％乙腈复溶并离心，取上清，然后用LC-MS/MS进行分析。
　　3.基因组羟甲基化的LC-MS/MS分析:DNA样品加入88％甲酸在140℃反应90min进行水解，氮气吹干，用90％乙腈复溶后离心，取上清，用LC-MS/MS进行分析。
　　[结果]
　　1.Vimentin基因甲基化的LC-MS/MS检测。对Vimentin基因进行CpG岛分析，发现基因exon1/2/3均含有密度较高的CpG岛，分别对各区域进行引物设计及PCR，成功扩增山Vimentin exon1(457bp)，exon2(309bp)和exon3(350bp)。另外，通过优化亚硫酸氢盐处理条件，得到其最佳转化条件为42℃反应30min，转化率为99.1％，还比较了不同SPE小柱对胞嘧啶(Cytosine，Cyt)和腺嘌呤(Adenine，Ade)的净化效果，发现MCX柱对Cyt及Ade的保留及净化效果最好，Cyt和Ade的回收率分别为91.4％和90.1％。对Cyt及Ade进行色谱和质谱条件优化，发现在梯度洗脱条件下以2.5 mM甲酸铵和乙腈为流动相，Cyt和Ade达到分离并且峰形较好。Cyt和Ade的线性范围为(2～200)ng/ml，其相关系数分别为0.9969和0.9995，相对标准差分别为1.87％～4.84％和2.69％～4.98％。Cyt和Ade的检出限(Limit of detection，LOD)分别为1pg/ml和5pg/ml，定量限(Limit of quantification，LOQ)分别为2pg/ml和14pg/ml，日内相对标准偏差(relative standard deviation，RSD)为1.48％～2.18％，日间RSD为2.46％～4.09％。Cyt和Ade的加标回收率为84.36％～96.59％。
　　2.通过分析20例结直肠癌患者肿瘤组织和癌旁组织Vimentin基因的甲基化，比较肿瘤组织与癌旁组织之间基因甲基化的差异，发现Vimentin exon1/2/3在肿瘤组织中的甲基化水平比癌旁组织的高并且具有显著性差异(P＜0.01)。比较不同肿瘤分期的结直肠癌患者中Vimentin exon1/2/3的甲基化差异，发现其甲基化水平与肿瘤分期无关。
　　3.基因组羟甲基化的LC-MS/MS检测。通过对色谱和质谱条件进行优化，发现Cyt、5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine，5mC)和5-羟甲基化胞嘧啶(5-hydroxymethylcytosine，5hmC)在亲水色谱中达到分离，而且排除了RNA的污染及胸腺嘧啶干扰的影响。Cyt、5mC和5hmC的线性范围分别为(1～500)ng/ml、(0.2～100) ng/ml和(0.1～50) ng/ml，其相关系数分别为0.9991、0.9989和0.9987。Cyt、5mC和5hmC的LOD分别为1pg/ml、45pg/ml和57pg/ml，LOQ分别为2pg/ml、90pg/ml和100pg/ml。Cyt、5mC和5hmC的日内和日间RSD范围为1.87％～4.98％，加标回收回收率为88.25％～104.39％。
　　4.通过LC-MS/MS分析结直肠癌患者肿瘤组织和癌旁组织的基因组羟甲基化程度，发现肿瘤组织中5hmC的水平显著低于癌旁正常组织(P＜0.01)并随着肿瘤分期的提高而降低(P＜0.05)。另外5hmC/5mC比值在肿瘤组织中降低(P＜0.01)但并不随结直肠癌分期的改变而改变。
　　5.通过分析组织中Vimentin基因甲基化及基因组羟甲基化程度，发现两者具有一定的相关性。结直肠癌患者肿瘤组织中Vimentin基因甲基化水平升高并伴随着基因组羟甲基化水平降低，其exonl/5hmC，exon2/5hmC，exon3/5hmC均显著高于癌旁正常组织(P＜0.01)。
　　[结论]
　　本文建立了LC-MS/MS分析候选基因甲基化及基因组羟甲基化水平的方法，并用该方法分析结直肠癌相关基因Vimentin的甲基化及基因组羟甲基化水平。结果显示:与癌旁组织相比，肿瘤组织中Vimentin exon1/2/3甲基化水平显著性升高，但在不同肿瘤分期没有差异，而5hmC的水平则显著性降低并随着肿瘤分期的提高而下降，另外还发现，癌变组织中Vimentin exonl/5hmC，exon2/5hmC，exon3/5hmC均显著性升高。这些结果表明，与癌旁正常组织相比，结直肠癌患者肿瘤组织中Vimentin基因甲基化与基因组羟甲基化水平存在显著性改变，这些变化可能与组织的癌变密切相关，结直肠组织中Vimentin基因甲基化的升高及基因组甲基化水平的降低可能导致细胞的癌变。该结果为结直肠癌诊断、治疗及预后标志物的研究提供了科学依据。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 研究背景

1．2 研究目的

1．3 研究内容

2 材料与方法

2．1 研究对象

2．2 Vimentin基因甲基化检测方法的建立

2．3 基因组羟甲基化检测方法的建立

3 结果

3．1 Vimentin基因甲基化检测方法的建立

3．2 结直肠癌及癌旁组织Vimentin基因甲基化分析结果

3．3 基因组羟甲基化检测方法的建立

3．4 结直肠癌基因组羟甲基化分析结果

3．5 Vimentin基因甲基化与基因组羟甲基化关系

4 讨论

4．1 液相色谱串联质谱检测基因甲基化水平方法

4．2 Vimentin基因甲基化与结直肠癌

4．3 液相色谱串联质谱检测基因组羟甲基化水平方法

4．4 基因组羟甲基化与结直肠癌

4．5 结直肠癌Vimentin基因甲基化与基因组羟甲基化关系

5 结论

参考文献

文献综述 结直肠癌与DNA甲基化

致谢

附录一 Vimentin基因扩增片段序列

附录二 缩写词中英文对照

附录三 在读硕士期间的科研情况