结构特异性核酸酶FEN1在DNA复制及细胞周期过程中的功能性研究

摘要

DNA复制过程中，校正功能缺失的聚合酶α起始冈崎片段的合成。然而，这种聚合酶合成DNA的准确率比其他DNA复制中的聚合酶δ或聚合酶ε要低很多。聚合酶α错配合成需由依赖MSH2的错配修复途径来纠正。通过研究，我们发现哺乳细胞中的FEN1也参与这种修复途径。根据实验结果，MSH2与FEN1相互作用并促进其核酸酶活性去除DNA底物的5'端错义配对，这个过程我们叫做α片段错配纠正(α-segment error editing，AEE)。FEN1内切酶活性和外切酶活性突变体蛋白在体外不能完成α片段错配纠正过程。突变体小鼠具有很强的突变表型，增加了细胞转化及肿瘤发生的几率。通过以上研究我们发现了一种FEN1/MutSα复合体参与的新的聚合酶α合成错配修复机制。
　　FEN1作为一个核酸酶，其活性及位置如果不能得到精密控制，携带有遗传信息的DNA可能会受到任意攻击，细胞周期也会发生紊乱。因此,FEN1在剪切完RNA引物并从PCNA上解离后的去向问题也值得深思。通过前期实验结果，发现FEN1蛋白表达量随着细胞周期阶段发生变化，在S期之后的G2/M期发生泛素化介导的降解(Ubiqutin-proteasome degradation pathway)。在这个课题中，我主要利用免疫共沉淀技术及质谱检测方法发现了介导了FEN1降解的泛素化酶激活酶E1:UBE1,结合酶E2:UBE2M以及连接酶E3:PRP19。
　　根据FEN1在细胞周期中程序性翻译后修饰的模型，甲基化的FEN1与PCNA分离时应首先进行去甲基化反应。通过研究，发现FEN1确实存在去甲基化情况，为了寻找这个FEN1的精氨酸去甲基化酶，我们在FEN1去甲基化过程中利用免疫共沉淀技术发现了潜在的精氨酸去甲基化酶JMJD1B。通过进一步地体外生化活性检测，基本确定JMJD1B蛋白具有特异催化精氨酸甲基化FEN1去甲基化的功能。这意味着我们首次发现了可以对非组蛋白精氨酸甲基化底物去甲基化的酶。

目录

声明

致谢

摘要

第一章 绪论

1．1 DNA分枝结构特异性内切酶-1(Flap endonuclease 1，FEN1)

1．2 FEN1研究进展

1．2．1 FEN1在DNA复制中的功能研究

1．2．2 FEN1在DNA损伤修复通路中的研究

1．2．3 FEN1在重复序列扩增(Repeat sequence expansions)中的功能研究

1．2．4 FEN1蛋白复合体的研究

1．2．5 FEN1的翻译后修饰及功能调节

1．2．6 FEN1在肿瘤中的研究

1．3 本文的理论依据和研究意义

第二章 FEN1／MutSα复合体在聚合酶α合成错配校正中的功能研究

2．1 引言

2．2 材料和方法

2．2．1 DNA底物的纯化与制备

2．2．2 细胞核的纯化及其提取物的制备

2．2．3 核酸酶活性分析

2．2．4 免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation)和亲和沉淀(Pull down)分析

2．2．5 RNA引物剪切实验

2．2．6 聚合酶α错配校正实验

2．2．7 免疫清除(Immunodepletion)hMSH2实验

2．2．8 A159V点突变转基因小鼠的构建及MEF细胞的培养

2．2．9 酵母菌基因敲除，突变率及突变图谱的分析

2．2．10 细胞转化实验

2．2．11 组织病理学分析

2．3 实验结果

2．3．1 冈崎片段成熟过程中存在聚合嚣α错配纠正过程

2．3．2 FEN1分枝结构特异性内切爵和外切膏活性的协同作用在α片段错配纠正过程中起I要作用

2．3．3 MSH2与FEN1相互作用并促进α片段错配纠正功能

2．3．4 FEN1／MutSα功能复合体缺陷导致的生物学结果

2．4 本章小结

第三章 细胞周期过程中FEN1翻译后修饰的研究

3．1 引言

3．2 实验材料和方法

3．2．1 细胞周期同步化

3．2．2 细胞预处理及免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation)方法

3．2．3 蛋白表达载体的构建及表达纯化

3．2．4 亲和沉淀(Pull down)分析

3．2．5 利用14C标记的甲基化供体SAM对FEN1进行甲基化标记

3．2．6 体外FEN1去甲基化反应

3．2．7 14C-meFEN1去甲基化释放含有14C甲醛的计数试验

3．3 实验结果

3．3．1 JMJD1B对甲基化的FEN1具有去甲基化酶活性

3．3．2 Co-IP技术检测FEN1相互作用蛋白复合体

3．3．3 FEN1翻译后修饰缺陷导致的生物学结果

3．4 本章小结

总结与展望

参考文献

附表

作者简历