FGF-2信号通路介导EGFR-TKIs快速获得性耐药的分子机制研究

摘要

目的：通过沉默或激活PC-9细胞（携带EGFR基因19外显子突变的NSCLC细胞株）中的内源性FGF2表达，同时添加吉非替尼与外源性FGF2，诱导PC-9细胞产生针对EGFR-TKIs快速获得性耐药的状态，筛选出FGF2介导的EGFR-TKIs快速获得性耐药的细胞模型，以进一步明确FGF-2信号通路介导EGFR-TKIs快速获得性耐药这一全新的耐药模式中所涉及的分子机制。
　　方法：⑴构建编码靶向FGF2基因shRNA及基于PAS（PCR-based Accurate Synthesis）的慢病毒载体，包装慢病毒，感染人肺癌细胞PC-9，以荧光定量PCR检测FGF2基因在mRNA水平的变化，以western blot检测FGF2蛋白表达水平的变化，筛选出FGF2沉默表达/高表达的细胞株。⑵PC-9细胞针对EGFR-TKIs快速获得性耐药状态的诱导及鉴定:对FGF2沉默表达（PC-9-FGF2-KD）或过表达细胞株（PC-9-FGF2-OE）单用吉非替尼或联用外源性FGF2，筛选出耐药细胞株。进一步用相关的生物学指标验证其耐药属性，生物学指标检测包括：以MTS法检测细胞增殖情况；以AnnexinⅤ/PI凋亡检测试剂盒检测时的细胞凋亡情况，以PI单染法检测细胞周期分布情况；软琼脂实验测定细胞锚定非依赖生长的影响；Transwell法测定细胞迁移和侵袭能力；实时荧光定量PCR法检测获得性耐药相关突变T790M突变和cMET扩增拷贝数。⑶以Affymetrix人全基因组3'IVT芯片检测PC-9-NC+FGF2、PC-9-FGF2-KD+FGF2、PC-9-FGF2-OE+FGF2，以及空白对照的PC-9细胞的差异基因表达改变。
　　结果：①采用慢病毒载体介导的转基因方法构建了FGF2基因沉默和FGF2基因高表达的PC-9细胞，Western Blot检测进一步在蛋白水平对细胞内FGF2的表达改变进行了验证，成功筛选出稳定的FGF2基因沉默(PC-9-FGF2-KD)和FGF2基因高表达（PC-9-FGF2-OE）的PC-9细胞株；②在FGF2基因过表达的PC-9细胞株（PC-9-FGF2-OE）及给予外源性FGF2的PC-9细胞株中均观察到细胞活力的增加，提示内外源性的FGF2刺激均有可能诱导出PC-9细胞针对EGFR-TKIs的快速获得性耐药;细胞生物学检测进一步表明PC-9-FGF2-OE+FGF2细胞株中出现显著的细胞凋亡率下降、细胞增殖分裂加快、细胞迁移和侵袭能力增强等耐药生物学行为，证实该细胞模型为FGF2介导的EGFR-TKIs快速获得性耐药的稳定的NSCLC细胞模型；③芯片检测发现PC-9-FGF2-OE+FGF2组细胞与PC-9-NC+FGF2组相比较而言，主要产生了PI3K-AKT通路、MAPK通路、ErbB通路和VEGF通路的上调，其中PI3K-AKT信号通路对FGF2介导的EGFR-TKIs快速获得性耐药的发生机制可能具有重要意义。
　　结论：⑴成功构建出FGF2介导的EGFR-TKIs快速获得性耐药的稳定的NSCLC细胞模型，为进一步揭示FGF-2信号通路介导EGFR-TKIs快速获得性耐药的分子机制奠定了研究基础；⑵PI3K-AKT信号通路可能在FGF2介导的EGFR-TKIs快速获得性耐药的发生机制中发挥重要作用。

目录

声明

致谢

摘要

第一部分 慢病毒介导的FGF2基因沉默／过表达PC-9细胞株的构建及其鉴定

1 前言

2 实验材料与仪器

3 实验方法

4 实验结果

5 讨论

6 结论

第二部分 FGF2介导的EGFR-TKIs快速获得性耐药细胞模型的构建和鉴定

1 前言

2 实验材料和仪器

3 实验方法

4 结果

5 讨论

6 结论

第三部分 FGF2介导的EGFR-TKIs快速获得性耐药细胞模型中的差异基因表达检测

1 前言

2 实验材料和仪器

3 实验方法

4 结果

5 讨论

6 结论

参考文献

综述 非小细胞肺癌EGFR-TKIs获得性耐药及策略

个人简介