宫外生长迟缓对肺血管影响及传代效应的表观遗传机制研究

摘要

目的：生命早期是个体发育的关键窗口期(critical window)，关系到整个生命周期的发育及健康，甚至可影响到子孙后代。自上世纪末Barker假说的提出后，大量流行病学以及实验室研究已经证实在这一时期营养环境的改变是导致个体成年期心血管代谢性疾病发病风险增加的诱因，并且这种效应可影响到子一代，子二代甚至一直遗传下去。宫外生长迟缓（Extrauterine growth restriction，EUGR）指婴儿生后的生长发育各计量指标（身长、体重等）在相应宫内生长速率期望值的第10百分位以下（≤生长曲线的第10百分位）。根据我国目前的出生率和早产发生率计算数据显示，每年出生约150万早产儿，其中EUGR发生率极高。最新的流行病学及动物模型研究显示EUGR可致成年期体循环及肺循环的血管功能发生改变，如发生体循环收缩压增高，肺动脉压增高，提示成年期心肺血管疾病的发生可能源于生命早期的营养打击，再一次印证了“多哈理论”即“健康与疾病的发育起源”(development originof Health and disease，DOHaD)学说。表观遗传学指基因的核苷酸序列不发生改变的调控基因表达的可遗传修饰。大量动物模型研究证实表观调控机制在发育起源的成人疾病，尤其是心血管代谢性疾病中发挥重要作用。在发育可塑期，不良环境使机体DNA甲基化、组蛋白修饰发生变化，改变了一些重要基因的表达，造成细胞、器官功能失调，发育受限等不良效应而最终发生疾病。这一过程也称为发育编程(development programming)。一方面，表观遗传机制如DNA甲基化具有稳定性。越来越多研究发现，这些表观修饰的改变在生命早期不良打击时已经发生，并且能够稳定持续至成年期。另一方面，表观遗传修饰本身能够遗传的特点，使得发育起源的成人疾病或生命早期的编程效应能够遗传至子代，并且已经在各种传代动物模型研究中得到证实。本课题组前期研究发现，EUGR大鼠在成年期发生肺动脉压增高，肺血管发生重塑。同时在血管功能调节的重要器官----内皮细胞中发现多个重要基因发生不同程度的表观遗传修饰改变，这与成年期发生肺血管功能改变密切相关。但EUGR是否在暴露后早期就已经引起表观修饰改变，影响到肺血管发育或功能;并且EUGR对父代肺血管的编程效应是否能够遗传到子代，影响子代的发育及肺血管功能。这些问题尚不清楚。本研究分为两个部分：
　　第一部分：宫外生长迟缓对生后早期肺血管密度影响及表观遗传机制研究。
　　目的：大量流行病学研究及动物模型发现生命早期营养不良可引起成年期高血压、肺动脉高压等疾病。这些心肺血管功能的失调可以追溯到生命早期不良环境暴露初期，已经引起机体重要基因的表达改变，影响到血管功能或结构，如血管密度稀疏。而表观遗传机制如DNA甲基化及组蛋白修饰在其中发挥了重要作用，并且这些修饰可以持续到成年期。我们的前期研究已经发现，EUGR可引起大鼠成年期肺动脉压增高，本研究旨在明确EUGR是否在大鼠生后早期就已经引起肺血管功能或结构的改变，并进一步明确可能引起这种效应的重要基因表达及相关的表观遗传调控机制。
　　方法：⑴模型建立:正常怀孕SD大鼠安置，将分娩后得到的新生仔鼠在生后24小时内以雌雄1∶1比例随机分配到正常组Control（每笼8-10只仔鼠），EUGR组（每笼18-20只仔鼠）。母鼠随机分配到每笼喂养仔鼠，予随机饮食。仅保留雄性大鼠做后续研究。⑵肺动脉压评估:3周离乳雄性SD大鼠，经开胸插管测量右心室平均收缩压。9周成年雄性大鼠，经颈静脉置管术测量平均肺动脉压。⑶血管稀疏度评估:3周及9周大鼠肺组织免疫组化染色，以von-Willebrandfactor(vWF)染色作为血管内皮标记，在病理切片中对肺血管进行计数。⑷免疫磁珠分选法提取肺血管内皮细胞，荧光定量RT-qPCR检测内皮细胞中Notch1基因及下游基因Hes-1，Hey-1，Hey-2的表达水平。⑸染色质免疫沉淀(chromatin immunoprecipitation，ChIP)分析Notch1基因启动子区组蛋白修饰情况;重亚硫酸盐测序分析Notch1基因启动子区CG位点的甲基化程度。
　　结果：①3周离乳大鼠右心室平均收缩压两组间无显著差异。9周成年期大鼠肺动脉平均压:EUGR组较Control组显著升高。3周离乳大鼠免疫组化染色显示，EUGR组肺血管密度低于Control组(P＜0.05)。9周成年大鼠两组肺血管密度无显著差异。②3周及9周EUGR肺血管内皮细胞中Notch1基因表达较Control组显著下降，且下游基因Hes-1表达也显著下降。③3周及9周Notch1基因近端启动子区EUGR组蛋白H3K27met3修饰水平较同龄Control显著增高。3周及9周EUGR组Notch1基因远端启动子区的CG位点较Control组发生甲基化程度增高。
　　结论：EUGR引起生后早期肺血管发育受限及成年期肺动脉压增高，与肺血管内皮细胞中Notch1表达下降密切相关。而Notch1基因启动子区组蛋白修饰及DNA甲基化发生改变可能是Notch1表达下降的潜在机制，并且这些修饰可持续到成年期。
　　第二部分：宫外生长迟缓对子代成年期肺动脉压的影响及表观遗传机制研究。
　　目的：生命早期不良环境不仅能够影响父代成年期健康，引起心血管代谢性疾病发病风险增高，而且这种不良效应还能够遗传到子代。这便是发育编程的传代效应。研究发现，DNA甲基化修饰是介导这一过程的重要分子机制。我们的前期研究已经发现EUGR可致成年期肺动脉压增高，肺血管功能失调。但这种不良效应能否遗传到子代尚不清楚。
　　方法：⑴传代模型建立:将成年期F0父代大鼠进行两两交配后，雌鼠分笼待产，所生的新生鼠根据其父代父母来源分为以下4组。母鼠予随机饮食。仔鼠出生3周后离乳，按性别分笼予随机饮食直至成年期。⑵体重评估:分别在出生、离乳期3周、成年期9周称重。⑶肺动脉压评估:9周成年大鼠，经颈静脉置管术测量平均肺动脉压。⑷免疫磁珠分选法提取肺血管内皮细胞，全基因组甲基化芯片检测父代及子代的DNA甲基化修饰情况，结果运用多种生物信息学方法分析。
　　结果：①子代大鼠体重各组之间无显著差异。②9周E♂-C早组雌性肺动脉压较C♂-C♀雌性显著下降(P＜0.001)，雄性子代肺动脉压末见显著变化。③全基因组DNA甲基化修饰分析，子代中发生差异甲基化修饰区域的数量较父代显著减少;父代中与血压调控相关的基因DNA甲基化修饰发生遗传丢失;父代与子代差异甲基化修饰的共同区域预测到包含AP2结合域在内的功能motif。
　　结论：EUGR对父代肺血管功能的影响能够遗传给子代，表现为性别差异遗传特点的代偿表型。从全基因组水平分析两代的DNA甲基化修饰特点发现，父代中参与血压调控基因的甲基化修饰印迹的遗传丢失以及差异甲基化修饰区域联合转录因子协同调节基因转录这两方面因素可能是EUGR传代效应以及子代表现为代偿表型的潜在机制。

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致谢

摘要

英文缩略词表

引言

第一部分 宫外生长迟缓对生后早期肺血管影响及表观遗传机制研究

前言

材料与方法

实验结果

讨论

结论

参考文献

第二部分 宫外生长迟缓对子代成年期肺动脉压的影响及表观遗传机制研究

前言

材料与方法

实验结果

讨论

结论

参考文献

综述 发育编程效应的世代遗传及表观遗传机制研究进展

作者简历及在读期间所取得的科研成果