支架蛋白GABs调控过敏性哮喘的病理生理学意义

摘要

哮喘是一种常见的慢性气道炎症性疾病，其主要特点是反复发作，伴有可逆的气流阻塞和支气管痉挛，主要临床病理表现为气道高反应性、黏液的过度分泌和以嗜酸性粒细胞浸润为主的炎症。有多种细胞特别是气道上皮、树突状细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、淋巴细胞等参与其发病过程。哮喘的发病是由遗传因素和环境因素（如过敏原，呼吸道病毒感染等）共同参与调控的，目前为止并无可以治愈哮喘的药物。研究哮喘的发病过程及其具体调控机制对于该疾病的预防和治疗具有非常重要的意义。
　　可逆磷酸化是普遍存在的蛋白翻译后修饰方式，由激酶及磷酸酶家族蛋白行使可逆酶促反应构成了细胞信号调控的化学本质，近年来许多研究提示支架蛋白（或锚定蛋白）虽不具有催化功能结构域，但与激酶与磷酸酶相互作用，在磷酸化信号的组织特异性与精细的时序调控发挥至关重要的作用。GAB蛋白家族(Grb2-associated binder)是一类生物体广泛存在的支架蛋白。Gab1和Gab2在哺乳动物体内广泛表达，主要由PH(pleckstrin homologue)结构域，酪氨酸基序，脯氨酸富集区构成。GABs本身并无酶活，它们的主要作用是在细胞信号传递过程中招募多种接头蛋白或酶分子（包括酪氨酸激酶和磷酸酶），完成信号的传递，进而参与了多种胞外刺激引发的信号通路，介导细胞的增殖、凋亡、迁移、极化等多种重要的生理过程。之前的研究认为支架蛋白Gab1和Gab2存在代偿和功能冗余的现象，但近年来越来越多的研究提示Gab1和Gab2功能存在组织特异性和差异性。近年来一项大规模的遗传学研究发现gab1是哮喘的一个新的易感基因，然而其在哮喘及过敏性炎症中的功能及其调控机制尚未报道。我们首先发现患有哮喘的小鼠外周血单核细胞中Gab1的表达显著增高，而Gab2的表达没有显著性变化，Gab2的表达是在哮喘小鼠的气道上皮中呈现了显著性的升高。同时在哮喘病人外周血(Peripheral blood mononuclear cells，PBMC)中也发现了同样的现象，提示Gab1、Gab2可能都参与了哮喘过敏性炎症过程，然而其调控机制存在差异。基于此，我们构建了Gab1 KO的小鼠(LysmCre-Gab1 flox/flox，髓系来源单核细胞Gab1条件性敲除).同时利用Gab2-/-的小鼠研究这两个蛋白在过敏哮喘中的病理与病理生理学意义。
　　首先我们研究发现气道上皮细胞中缺失Gab2会导致IL-13诱导的黏液蛋白分泌的减少，同时利用鸡卵清蛋白(ovalbumin，OVA)诱导哮喘模型的Gab2-/-小鼠表现气道黏液分泌降低，进而缓解气道炎症的遗传学表型。PI3K/AKT、IL-13/TYK2/STAT6信号在调控气道上皮黏液分泌过程中具有关键性意义。后续机制的研究进一步显示Gab2参与了正向调控IL-13/TYK2/STAT6通路，Gab2能够与TYK2/STAT6通路的负反馈调控因子SOCS3竞争性地结合到TYK2上，因此当Gab2在气道上皮中缺失后，会导致更多的SOCS3结合到TYK2上，从而促进了TYK2的泛素化降解，使得STAT6的磷酸化显著低于正常水平，从而正向调控了气道上皮的黏液分泌。
　　同时我们还发现Gab1在髓系来源细胞的缺失会导致OVA诱导的过敏性哮喘缓解，主要表现为包括Th2型炎症因子的浸润减少，以嗜酸性粒细胞为主的炎症细胞的浸润减少，杯状细胞的化生和黏液分泌的减少。通过过继转移实验，证实了树突状细胞(dentritic cell，DC)中Gab1的缺失影响了树突状细胞的功能导致了哮喘的缓解，排除了巨噬细胞(macrophage)中Gab1缺失的影响。后续的研究显示Gab1正向调控了CCL19介导的树突状细胞向淋巴结的迁移进而阻碍了DCs将加工处理好的抗原提呈给T细胞，最终阻断了获得性免疫的开启，缓解过敏性哮喘。
　　基于以上研究，我们认为支架蛋白Gab1和Gab2作为支架蛋白GABs家族中最主要的两类蛋白，在过敏性哮喘中发挥着不同的精细调控作用，Gab1通过影响树突状细胞的迁移影响过敏性哮喘的病理过程，Gab2正向调控了气道上皮的化生和黏液分泌过程。该研究可以帮助更好地理解过敏性哮喘的病理过程，并为该疾病的诊断治疗提供新的潜在靶点。

目录

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致谢

摘要

英文缩略词表

第一章：支架蛋白Gab2介导TYK2／STAT6通路调控气道上皮黏液的分泌和杯状细胞的化生

1．引言

2．材料和试剂

2．1 主要仪器

2．2 主要试剂耗材

2．3 小鼠

2．4 细胞

3．实验方法

3．1 免疫组化

3．2 siRNA细胞转染

3．3 质粒细胞转染

3．4 细胞RNA提取(Trizol法)及荧光定量PCR

3．5 细胞免疫荧光

3．6 小鼠哮喘模型的建立以及肺泡灌洗液获取

3．7 肺组织切片和HE染色

3．8 组织免疫荧光

3．9 WST-1细胞增殖检测

3．10 细胞凋亡检测(流式细胞法)

3．11 PAS染色(过碘酸-Schiff反应)

3．12 酶联免疫吸附试验(ELISA)

3．13 骨髓置换实验

3．14 蛋白制样

3．15 蛋白质印记法(Western blot)

3．16 免疫共沉淀(Co-IP)

4．实验结果

4．1 Gab2的表达与气道黏液分泌相关性研究

4．2 体外实验显示Gab2正向调控黏液基因的表达

4．3 Gab2缺失缓解了OVA诱导的杯状细胞化生和黏液分泌

4．4 Gab2缺失缓解了OVA诱导的气道炎症

4．5 骨髓置换实验进一步证实Gab2正向调控了体内杯状细胞的化生黏液的分泌

4．6 Gab2正向调控IL-13介导的TYK2／STAT6信号通路

4．7 Gab2的缺失增强了SOCS3与TYK2的结合，抑制IL-13诱导的TYK2／STAT6通路

5．讨论

6．结论

参考文献

第二章：支架蛋白Gab1在髓系来源树突状细胞介导的过敏性哮喘中作用的研究

1．引言

2．材料和试剂

2．1 主要仪器

2．2 主要试剂耗材

2．3 小鼠

2．4 细胞

3．实验方法

3．1 小鼠哮喘模型的建立以及肺泡灌洗液处理

3．2 肺组织切片和HE染色

3．3 免疫组化

3．4 PAS染色

3．5 人或者小鼠外周血单核细胞分离

3．6 BMDM和BMDC的过继转移实验

3．7 细胞RNA提取(Trizol法)及荧光定量PCR

3．8 DC纯化

3．9 CD4 T细胞纯化

3．10 DC抗原吞噬实验

3．11 DC成熟实验

3．12 DC抗原递呈实验

3．13 体内T细胞增殖实验

3．14 体内DC迁移实验

3．15 体外DC迁移实验(Transwell实验)

3．16 酶联免疫吸附试验(ELISA)

3．17 蛋白制样

3．18 蛋白质印记法(Western blot)

4．实验结果

4．1 髓系来源细胞缺失Gab1缓解了OVA诱导的过敏性哮喘

4．2 过继转移实验表明Gab1通过影响树突状细胞功能影响过敏性哮喘的发生

4．3 Gab1缺失对树突状细胞的抗原吞噬，成熟以及抗原递呈无影响

4．4 Gab1的缺失阻断了树突状细胞向淋巴结的迁移

4．5 Gab1正向调控了树突状细胞的定向迁移

5．讨论

6．结论

参考文献

综述 过敏性哮喘中杯状细胞化生的调控

作者简历及在读期间取得的科研成果