K+-Cl-协同转运蛋白2在创伤性脑损伤中的作用及褪黑素神经保护机制的实验研究

摘要

研究背景及目的：
　　创伤性脑损伤(traumatic brain injury，TBI)是神经外科的常见病、多发病，具有高发病率、高致残率和高死亡率等特点，是急需解决的临床问题。兴奋性氨基酸的过度释放被认为是TBI后继发性损伤机制的起始因素，其神经毒性作用对患者的预后产生重要的影响。KCC2作为成熟神经元细胞氯离子浓度梯度的关键调节因子，在脑内GABA介导的内源性抑制性神经传递作用中发挥重要作用。然而，到目前为止，有关KCC2在TBI中的抗兴奋毒性损伤作用及其病理生理意义研究甚少。另一方面，褪黑素(melatonin，Mel)作为是一种由松果体合成与分泌的吲哚胺类神经内分泌激素，具有抗炎和抗氧化等多种神经保护作用。在TBI模型中，Mel能够减少TBI后脑组织细胞死亡，但其具体的分子作用机制尚未明确。
　　本研究拟通过研究KCC2在TBI后皮层脑组织中动态表达及分布情况，探讨KCC2的表达水平与TBI的相互关系，以期为TBI的治疗提供一个新靶点。其次，本课题试图验证褪黑素对TBI大鼠具有脑保护作用，并探索该作用是否与脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor，BDNF)/细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)/KCC2信号通路的激活及神经元凋亡被抑制相关，为探索抑制TBI后神经元凋亡开拓新的研究思路。
　　研究方法：
　　根据不同的实验内容，该研究分两部分:
　　(1)该实验拟研究KCC2在TBI后皮层脑组织中动态表达及分布情况，探讨KCC2的表达水平与TBI的相互关系。采用定量脑皮质挫伤方法建立TBI模型后，检测大鼠损伤侧皮层脑组织中KCC2蛋白表达水平在TBI后0h，3h，6h，12h，24h，72h及168h的表达状况。采用荧光定量PCR技术检测KCC2 mRNA在TBI后168h内损伤侧皮层脑组织中表达水平随时间的变化趋势。采用免疫荧光技术观察KCC2与神经元及胶质细胞共定位的情况。
　　(2)该实验拟探讨大鼠TBI后褪黑素治疗在神经元凋亡中的作用，并探讨该作用是否与脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor，BDNF)/细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)/KCC2信号通路激活及神经元凋亡被抑制相关。雄性SD大鼠随机分成以下3组:sham+vehicle组;TBI+vehicle组;TBI+褪黑素组。于TBI建模成功后5min，1h，2h，3h，4h腹腔给予褪黑素或相应等体积的vehicle（生理盐水+95％乙醇）。手术后24 h取假手术组、损伤组和治疗组损伤中心区皮层组织行FJB染色(Fluoro-Jade B staining)检测神经元变性坏死水平;对损伤侧皮层BDNF、ERK、p-ERK、KCC2和活化的caspase-3表达水平进行检测;用TUNEL染色与NeuN共染评估神经元凋亡状况;采用改良的神经功能缺损评分(mNSS)评价各组大鼠手术后24h神经功能缺损状况;同时采用干/湿重称量法计算各组大鼠手术后24h脑组织含水量脑组织含水量并进行统计分析。
　　研究结果：
　　(1)研究发现，TBI后损伤侧皮层脑组织中的KCC2蛋白量呈降低趋势，于12h开始出现显著降低(p＜0.05)，直至伤后168h(p＜0.05)。荧光定量PCR结果显示:与0h组相比，损伤侧皮层脑组织KCC2 mRNA水平在损伤后6h开始即出现显著降低(p＜0.05)，持续至伤后168h(p＜0.05)。免疫荧光结果显示:KCC2与 NeuN，而非GFAP共染;此外，KCC2表达于细胞膜而非定位于细胞核中。
　　(2)与sham+vehicle组比较，TBI后大脑皮层BDNF、p-ERK和KCC2的表达明显降低，而激活态的caspase-3表达水平明显增加，同时神经元凋亡、脑水肿及神经功能缺损明显加重(P＜0.05);与TBI+vehicle组比较，褪黑素干预后大脑皮层BDNF、p-ERK和KCC2的表达明显升高，神经元凋亡减少，脑水肿减轻，同时神经功能得到改善(P＜0.05)。
　　研究结论：
　　TBI后损伤侧皮层脑组织中神经元特异的KCC2蛋白及mRNA表达水平持续降低，提示其可能参与了TBI后继发性损伤的病理过程。进一步研究发现，KCC2表达下调可能促进了TBI后神经元凋亡。Mel能促进脑源性神经营养因子(brainderived neurotrophic factor, BDNF)的表达及细胞外调节蛋白激酶(extracellularregulated protein kinases，ERK)的激活，进而上调KCC2的表达，从而缓解TBI后caspase-3激活及神经元凋亡，并减轻脑水肿及改善TBI后的神经功能缺失。

目录

声明

致谢

摘要

缩略词表(abbreviate)

1 前言

2 材料和方法

2．1 材料和主要设备

2．2 动物分组及给药

2．3 TBI动物模型的建立

2．4 大鼠的神经功能评分

2．5 脑组织含水量检测

2．6 神经元变性坏死检测

2．7 蛋白Western blot分析

2．8 荧光定量PCR

2．8 免疫组织化学染色

2．9 统计学分析

3 结果

3．1 KCC2在TBI后皮层脑组织中动态表达及分布情况

3．2 褪黑素的保护作用

4 讨论

参考文献

综述 K+-Cl-协同转运蛋白2和氯离子稳态：急性中枢神经系统损伤潜在的治疗靶点

个人简历