奶牛瓣胃上皮细胞对小肽的吸收机制及小肽转运载体1的特征研究

摘要

小肽是奶牛的重要氮源和牛奶中乳蛋白形成的重要前体物，并且能被胃肠道大量吸收。本研究围绕奶牛瓣胃上皮细胞(Omasal epithelial cells，OEC)及小肽转运载体1（Peptide transporter1，PepT1），探索瓣胃及PepT1吸收小肽的机制。首先，成功建立了奶牛OEC体外培养模型;其次，研究了OEC对小肽摄取和转运的机制，发现PepT1在奶牛OEC吸收小肽过程中发挥着重要作用;最后，比对分析了奶牛PepT1(bovine PepT1，bPepT1)的结构特征，并对其表达功能特征和分布规律进行了研究。主要研究结果如下:
　　1.奶牛OEC体外培养模型的建立及其功能检测
　　该部分旨在建立奶牛OEC体外培养模型。瓣胃组织取自4头新生的中国荷斯坦犊牛，采用2.5％胰蛋白酶连续消化分离得到游离细胞，将细胞培养在含10％血清、10 ng/mL表皮生长因子、5μg/mL胰岛素、100 U/mL青霉素、100μg/mL链霉素、50μg/mL庆大霉素和2.5μg/mL两性霉素B的DMEM高糖培养基中，通过H&E组织染色发现瓣胃上皮层已完全被消化酶分离下来。利用酶差消化法和相差贴壁法对OEC进行纯化，纯化后的OEC呈现典型的上皮细胞铺路石状形态特征，纯度达90％以上。通过免疫荧光染色检测到上皮细胞内角蛋白CK18和PepT1的表达，通过反转录PCR方法在上皮细胞中检测到存在PepT1的mRNA表达，通过扫描电镜和透射电镜观察到上皮细胞表面存在微绒毛，并且在细胞间有桥粒、紧密连接结构、基底层折叠和张力细丝等典型上皮细胞的结构出现，并存在极化现象;细胞具有典型的“S”型细胞增长曲线，且至少可传至10代。通过对OEC摄取2.5 mM二肽glycylsarcosine（Gly-Sar，甘氨酸-肌氨酸）功能进行研究，结果发现OEC可完整地摄取Gly-Sar并呈现pH依赖性（最佳pH5.5-6.5）、时间依赖性（在10 min时达到饱和）、浓度依赖性和温度依赖性;此外还发现Gly-Sar在浓度较低时(＜1.5 mM)，通过PepT1载体途径的转运量较大，说明低浓度小肽存在时PepT1更易发挥作用。另外，这种摄取可以被Met-Gly二肽竞争性的抑制，而不被游离氨基酸(Free amino acid，FAA)抑制。综上所述，OEC体外培养模型已成功建立，并且PepT1在其摄取小肽过程中发挥着重要作用，所培养的OEC可以作为体外研究瓣胃小肽吸收功能的模型。
　　2.PepT1在奶牛OEC吸收二肽中的功能及影响因素
　　该部分旨在研究奶牛OEC对Gly-Sar的摄取、转运及其影响因素，探讨PepT1基因在OEC吸收小肽过程中发挥的作用。免疫荧光化学检测发现铺满的OEC细胞层有紧密连接蛋白(ZO-1和闭合蛋白)的表达，尤其在细胞连接处表达量更多;检测铺于Transwell滤膜OEC细胞层的电阻值和渗透性发现细胞层的电阻值在一周时达到平台期，荧光素钠的渗透率为0.63％，显著低于对照组(无细胞组，12％)，说明细胞层已紧密形成，可以进行转运试验。通过控制孵育细胞的温度、pH、时间、浓度、二乙烯焦碳酸酯（DEPC）和竞争肽及LPS的存在与否等不同条件，检测下室中的小肽量，结果发现OEC在37℃时的转运量显著高于4℃(P＜0.05)，并具有pH依赖性，OEC对Gly-Sar的摄取和转运可以被PepT1的His残基抑制剂DEPC显著抑制(P＜0.05)，也可被其他竞争性二肽抑制(P＜0.05)，但不被FAA抑制;从上室转运到下室的小肽量为反方向的3倍，说明小肽转运存在方向性。另外，siRNA特异性的干扰OEC的PepT1基因表达可显著降低其对Gly-Sar的吸收(P＜0.05)，然而过表达OEC的PepT1可以显著增加Gly-Sar的吸收(P＜0.05);此外结果还发现不同种类(Gly-Sar、Lys-Lys和Met-Lys)和不同浓度（0.25 mM、2.5 mM和10mM）的小肽可显著提高OEC的PepT1蛋白表达量(P＜0.05)。此外，结果还发现LPS可以上调PepT1基因的表达，降低膜电阻，增加OEC对小肽的转运量;另外，通过对瘤胃上皮细胞层与OEC细胞层的小肽转运能力进行比较，发现瓣胃上皮的小肽转运能力显著高于瘤胃。综上所述，PepT1基因可能在奶牛OEC吸收小肽过程中起着重要作用，并受LPS的影响。
　　3.奶牛PepT1的功能表达和分布规律
　　通过对克隆的全长奶牛bPepT1氨基酸序列与其他25个物种进行序列比对和结构预测分析，发现bPepT1与其他物种PepT1的氨基酸序列具有较高的同源性，同源性由高到低依次为山羊(96.2％)、绵羊(95.2％)、马(85.9％)、猪(85.6％)、狗(83.4％)、人(83.0％)、鼠类(82％-83％)、猴类(81％-83％)、兔(78.6％)、禽类(64％)、鱼类(56％-61％);奶牛bPepT1蛋白结构中含有12个跨膜区、2个PKA位点、4个PKC位点和6个N连接糖基化位点，并且在跨膜区9和10间存在一个大胞外环。利用Western blot分析了奶牛bPepT1的胃肠道组织分布规律，发现空肠和回肠的bPepT1蛋白表达量显著高于其他部位（P＜0.05），表达量最低的部位为瘤胃，奶牛bPepT1蛋白表达量从高到低依次为:空肠＞回肠＞十二指肠＞瓣胃＞瘤胃，说明奶牛空肠和回肠可能具有较前胃更强的小肽转运能力。另外，将真核表达载体pcDNA3.1/bPepT1转染到中国仓鼠卵母(CHO)细胞内，并成功表达了bPepT1基因和功能，转染的CHO细胞对0.02 mM同位素标记的[3H]-Gly-Sar的摄取在10min时达到饱和，并存在pH依赖性，最佳摄取pH为6.5-7.0(pH梯度为:5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5);存在浓度依赖性（浓度梯度为:0.02-10 mM），米氏常数Km(代表亲和力)为0.94±0.06 mM，最大转运速率Vmax为20.80±1.74 nmol/(mg protein·5 min)，属于低亲和力高容量载体。通过检测其他16种含Met和Lys等EAA的小肽的IC50(抑制[3H]-Gly-Sar吸收量一半时所需要抑制肽的浓度，IC50越大表示亲和力越小)，发现bPepT1对不同小肽的亲和力不同，其中11种小肽的IC50在0.014-0.096 mM之间(Trp-Phe、Met-Lys、Met-Glu、Gly-Met、Lys-Met、Met-Gly、Gly-Lys、Met-Leu、Lys-Phe、Met-Met和Met-Leu-Phe），说明bPepT1对这些小肽有很高的亲和力;另外4种小肽（Lys-Lys、Leu-Gly-Gly、Lys-Trp-Lys和Met-Gly-Met-Met）的IC50大于2.069mM，说明它们不易被bPepT1转运，其中Lys-Lys几乎不被转运(IC50大于10mM);此外，在FAA存在时并没有抑制现象。总之，本试验是初次系统研究奶牛bPepT1的表达功能特点，并发现bPepT1可广泛转运二肽和三肽，对C端含Lys的肽、含正电荷的肽、长链肽不易转运，并具有种属特异性。
　　综上所述，本文成功建立了体外研究奶牛小肽吸收的OEC培养模型，发现bPepT1在OEC吸收小肽过程中发挥了重要作用，并且奶牛PepT1可广泛转运二肽和三肽，且有种属特异性。

目录

声明

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摘要

第一章 文献综述

第一节 小肽的作用及其在反刍动物前胃中的吸收

1．1 小肽吸收意义

1．2 反刍动物前胃与门静脉小肽数量

1．3 反刍动物前胃对小肽的吸收

1．4 小肽吸收机制

1．5 生物活性肽

第二节 小肽转运载体(PepT1)的结构特点及分布规律

2．1 PepT1的结构特点

2．2 PepT1的转运机制

2．3 PepT1的克隆表达

2．4 PepT1的底物特异性

2．5 PepT1的分布规律

第三节 PepT1表达和功能的影响因素

3．1 疾病

3．2 昼夜节律

3．3 miRNA

3．4 激素

3．5 发育

3．6 日粮

第四节 小肽吸收转运的研究模型

4．1 动物模型

4．2 组织模型

4．3 刷状缘膜囊泡

4．4 细胞系

4．5 原代细胞

第五节 研究目的意义与内容

5．1 本研究的目的和意义

5．2 本研究的主要内容

第二章 奶牛瓣胃上皮细胞(OEC)体外培养模型的建立

1 材料

1．1 瓣胃组织来源及取样

1．2 主要试剂及配制

1．3 主要仪器和耗材

2 方法

2．1 细胞培养条件

2．2 细胞原代分离

2．3 苏木精和伊红(H＆E)组织染色

2．4 细胞纯化传代

2．5 细胞冻存与复苏

2．6 细胞生长曲线

2．7 OEC超微结构观察

2．8 免疫细胞化学鉴定

2．9 OEC的PepT1基因检测

3 结果与分析

3．1 原代OEC生长和形态观察

3．2 OEC生长曲线

3．3 OEC超微结构观察

3．4 OEC的鉴定和PepT1的检测

3．5 PepT1引物特异性

4 讨论

第三章 奶牛OEC对Gly-Sar吸收机制的研究

第一节 奶牛OEC对Gly-Sar的胞内摄取机制研究

1．材料

2 方法

3 结果与分析

4 讨论

第二节 奶牛OEC对Gly-Sar跨膜转运功能的研究

1 材料

2 方法

3 结果与分析

4 讨论

第三节 siRNA干扰与过表达PepT1对OEC摄取Gly-Sar的影响

1 材料

2 方法

3 结果与分析

4 讨论

第四章 奶牛小肽转运载体PepT1的功能特征及组织分布

1 材料

2 方法

3 结果与分析

4 讨论

第五章 结论、创新点与研究展望

1 主要结论

2 创新点

3 研究展望

参考文献

作者简历及论文发表情况

致谢