套袋促进红色砂梨着色的转录模式及梨GST基因家族分析

摘要

红色砂梨着色主要依赖果皮内花青苷的积累，相关生理和分子机制研究已取得重要进展，但套袋促进红色砂梨着色的分子机制尚不清楚。本研究以红色砂梨‘美人酥’为试材，幼果期套不透光果袋，成熟期摘袋，并于摘袋后0小时(hour,H)、3H、6H、24H、72H、144H、240H取样，以相同时期的套袋果实为对照(control,HC)，获得摘袋过程中不同响应时期的样品，测定果实生理品质。根据光响应特点和果皮中花青苷的积累模式，选取0H、6H、6HC、24H、24HC、144H、144HC进行转录模式分析。研究结果如下:
　　1)套袋‘美人酥’果实中花青苷、类胡萝卜素、叶绿素含量均很低，花青苷在摘袋后72小时开始积累，至240小时达到较高水平;叶绿素和类胡萝卜素含量在摘袋3小时后即轻微上升，但至240小时仍处于较低水平;说明套袋通过改变花青苷/（叶绿素+类胡萝卜素）比值改善了红色砂梨着色。
　　2)21个cDNA文库的转录组测序共获得94.20 Gb数据，469，327，557对长度为100 bp的原始reads。过滤掉低质量序列后，约70％的reads可以比对至参考基因组。将reads进行组装并与参考基因模型比较，预测了1，198个新基因。将所有已知基因和新预测基因与五大蛋白数据库进行比对，40，935个基因得到功能注释。
　　3)‘美人酥’果实摘袋着色过程中共产生了8，544个显著差异表达基因。植物的光响应、植物激素和糖的生物合成及信号转导相关的GO类群均显著富集，说明相关基因可能在红色砂梨果实的摘袋响应过程中发挥着重要调节作用。利用Q-PCR技术检测了8个基因的相对表达量，结果与RNA-Seq检测到的基因表达水平一致，说明RNA-Seq在检测基因表达丰度方面具有高度的准确性。
　　4)果实摘袋后，大部分花青苷合成结构基因均呈现上调表达;573个转录因子编码基因显著差异表达，GO分类显示其中66个基因与花青苷合成有关;光受体和下游元件编码基因表达水平没有一致的规律，说明光受体和下游元件的光响应主要发生在蛋白水平。对激素和糖合成路径基因的表达模式做了系统分析，发现大部分ABA、ETH、JA、SA合成路径基因上调表达，AUX、GA合成路径基因下调表达，蔗糖合成路径基因没有呈现一致的变化趋势，说明它们在梨的摘袋着色过程中发挥着不同作用。
　　本研究还利用生物信息学方法对梨GST基因家族做了全基因组鉴定，得到了分属于7个亚家族的82个基因。系统进化分析发现该基因家族的U、L、DHAR和THCQD类型出现了亚族单独扩增的现象，而其他类型基因在数目上较为保守。鉴定了15个GST基因的保守氨基酸基序，发现大部分基序为两个GST基因的保守结构域GST N和GST C的组成部分。GST基因家族在表达水平上呈现明显的组织特异性和模式多样性，19个GST基因在本试验中发生显著差异表达。GO分类结果显示这些基因广泛参与各项生命活动，在植物生长发育中发挥重要作用。
　　对PpMYB12和PpGSTF12进行了序列分析和表达分析，克隆到的基因编码序列与参考基因组的相应序列相似度分别为98％和100％。它们的启动子区域均含有丰富的光、激素和温度响应元件，说明其表达受到多种环境和生理因子的调节。PpMYB12的表达水平在果实摘袋后迅速升高，PpGSTF12在果实摘袋72小时后才明显上调，此后保持在较高水平。根据其基因功能注释结果和显著的光响应表达特征，推测它们可能分别参与了花青苷合成的调节和转运。

目录

声明

致谢

摘要

缩略语表

1 绪论

1．1 红色砂梨着色的生理及分子基础

1．1．1 花青苷的结构、组分、合成和转运

1．1．2 花青苷的生物合成和转运

1．1．3 花青苷合成和转运过程中的调节基因

1．2 植物的光受体及光信号转导路径

1．3 植物激素和糖对花青苷合成的影响

1．4 高通量测序的原理及应用

1．5 立题依据及研究内容

2 红色砂梨‘美人酥’果实摘袋后的品质变化

2．1 材料与方法

2．1．1 试验材料及处理

2．1．2 试验方法

2．2 结果与分析

2．2．1 ‘美人酥’果实的果形指数、单果重、可溶性固形物和硬度变化

2．2．2 摘袋和套袋样品中‘美人酥’的果实外观

2．2．3 摘袋对‘美人酥’果皮内色素含量的影响

2．3 讨论

3 红色砂梨‘美人酥’摘袋着色期间的转录模式分析

3．1 试验材料与方法

3．1．1 试验材料

3．1．2 试验方法

3．2 结果与分析

3．2．1 RNA质量检测

3．2．2 测序质量和产出统计

3．2．3 测序质量评估

3．2．4 新基因预测及基因功能注释

3．2．5 梨基因的表达模式

3．2．6 差异表达基因的识别

3．2．7 差异表达基因的实时荧光定量PCR技术验证

3．3 花青苷合成相关基因的识别与分析

3．3．1 花青苷合成结构基因的表达模式

3．3．2 调节基因的表达模式分析

3．3．3 光受体和下游元件编码基因的表达模式

3．3．4 激素和蔗糖合成路径相关基因

3．4 讨论

4 梨GST基因家族的生物信息学分析

4．1 材料和方法

4．2 结果与分析

4．2．1 梨GST基因的数量及命名

4．2．2 梨GST基因的位置及特征

4．2．3 梨和拟南芥GST基因的系统进化分析

4．2．4 梨GST蛋白的结构和保守结构基序分析

4．2．5 梨GST基因的功能分类

4．2．6 梨GST基因在‘美人酥’摘袋着色期间的表达模式

4．2．7 花青苷转运候选GST基因

4．3 讨论

5 PpMYB12和PpGSTF12的序列和表达分析

5．1 材料与方法

5．1．1 试验材料

5．1．2 试验方法

5．2 结果与分析

5．2．1 PpMYB12和PpGSTF12的基因结构分析

5．2．2 PpMYB12和PpGSTF12启动子序列分析

5．2．3 PpMYB12和PpGSTF12系统进化分析

5．2．4 PpMYB12和PpGSTF12基因表达分析

5．3 讨论

6 小结与展望

参考文献

作者简历