Pmk1、Cpka和MagA基因在内生真菌稻镰状瓶霉(Harpophora oryzae)与水稻共互作中的功能分析

摘要

MAPK信号途径和cAMP信号途径控制着真菌的菌丝生长、发育和繁殖过程，这些信号过程中的核心基因在植物和人类病原菌的致病过程中起着必不可少的作用。目前为止，这两种信号途径在植物病原真菌中已经得到广泛的研究，但是在内生真菌中却少有研究。内生真菌在提高寄主植物的抗生物和非生物胁迫中发挥着重要作用，对植物病害的生物防治具有重要的意义，因此了解MAPK信号途径和cAMP信号途径在内生真菌中的作用，能够更好的了解内生真菌与植物互作的机理，为内生真菌的生物防治应用提供更全面的理论支持。
　　稻镰状瓶霉(Harpophora oryzae)是从水稻根部分离的一种暗色有隔内生真菌，能够在水稻根部侵染定殖，促进水稻的生长并提高其对稻瘟病的抗性。根据稻镰状瓶霉基因组测序结果及其同源基因比对，得到MAPK信号途径中的编码MAPK的基因Pmk1、cAMP-PKA信号途径中的PKA催化亚基Cpka及其上游G蛋白调控因子MagA，发现其与植物病原真菌中的相应基因高度同源。利用同源置换的方法得到敲除突变体ΔPmk1、ΔCpka和ΔMagA。
　　ΔPmk1与野生型相比，菌丝生长严重受阻，黑色素沉淀减少，但是产孢能力未受到影响，其不能形成附着胞，也不能在划伤的大麦叶片上侵染和在水稻根部侵染。ΔCpka突变体菌丝生长减缓，丧失了在固体和液体培养基中的产孢能力，ΔMagA突变体在菌丝生长和产孢能力上和野生型无显著差异，但是ΔCpka和ΔMagA突变体均能够在疏水膜上正常形成附着胞，也都和野生型一样在划伤的大麦叶片上形成致病斑，并正常侵染到水稻的根部，对水稻的促生效应没有因为基因的缺失而丧失。此外Pmk1、Cpka和MagA三个基因不参与到细胞壁完整性的调控。
　　综上所述，Pmk1基因参与菌丝的生长和对寄主的侵染，是稻镰状瓶霉与水稻共生互作所必需的;Cpka在稻镰状瓶霉的菌丝生长和产孢过程中具有着重要的作用，但不影响与水稻的共生互作;MagA不影响稻镰状瓶霉的菌丝生长、产孢和与寄主的共生互作。

目录

声明

致谢

摘要

第一章 文献综述

1 内生真菌研究概况

1．1 内生真菌的概念

1．2 内生真菌的分类

1．3 内生真菌的生物功能

2 暗色有隔真菌研究概况

2．1 暗色有隔真菌的概念

2．2 暗色有隔内生真菌的侵染结构和侵染模式

3 MAPK信号通路

3．1 植物病原真菌的MAPK信号通路组成

3．2 酿酒酵母中MAPK信号通路研究概况

3．3 稻瘟病菌中MAPK信号通路研究概况

3．4 其他植物病原真菌中MAPK信号转导途径研究概况

4 cAMP信号转导途径

4．1 植物病原真菌cAMP信号转导途径的组成

4．2 酿酒酵母中的cAMP-PKA信号转导途径研究概况

4．3 稻瘟病菌中的cAMP-PKA信号转导途径研究概况

4．4 其他植物病原真菌中的cAMP-PKA信号转导途径研究概况

5 本项研究目的意义

第二章 稻镰状瓶霉Pmk1基因的功能分析

2．1 材料与方法

2．1．1 试验菌株和培养、保存条件

2．1．2 常规分子生物学实验技术

2．1．3 敲除载体构建的方法

2．1．4 稻镰状瓶霉的T-DNA转化

2．1．5 稻镰状瓶霉DNA提取

2．1．6 突变体表型分析

2．1．7 Pmk1的保守结构域分析及进化树的构建

2．1．8 数据分析

2．2 结果分析

2．2．1 稻镰状瓶霉Pmk1的分析与敲除

2．2．2 ΔPmk1突变体菌落形态和孢子产生

2．2．3 ΔPmk1在疏水性表面的孢子萌发和附着胞形成

2．2．4 ΔPmk1突变体致病性分析

2．2．5 双氧水H2O2敏感性测定

2．2．6 ΔPmk1基因缺失对稻镰状瓶霉细胞壁完整性影响

2．2．7 Pmk1基因缺失对稻镰状瓶霉耐环境胁迫的影响

2．3 本章讨论

第三章 稻镰状瓶霉CpkA和MagA基因的功能分析

3．1 材料与方法

3．1．1 试验菌株和培养、保存条件

3．1．2 常规分子生物学实验技术

3．1．3 敲除载体构建的方法

3．1．4 稻镰状瓶霉的T-DNA转化

3．1．5 稻镰状瓶霉DNA提取

3．1．6 突变体表型分析

3．1．7 Cpka和MagA的保守结构域分析及进化树的构建

3．1．8 数据分析

3．2 结果分析

3．2．1 稻镰状瓶霉Cpka和MagA的分析与敲除

3．2．2 ΔCpka突变体和AMagA突变体的菌落形态

3．2．3 ΔMagA在疏水性表面的孢子萌发

3．2．4 ΔCpka和ΔMagA致病性分析

3．2．5 双氧水H2O2敏感性测定

3．2．6 Cpka或MagA基因缺失对稻镰状瓶完整性影响

3．2．7 Cpka或MagA基因缺失对稻镰状瓶霉耐环境胁迫的影响

3．3 本章讨论

第四章 试验总结与展望

参考文献

附表