线粒体ND4和ND6基因突变在Leber遗传性视神经病变发病中的作用

摘要

Leber遗传性视神经病变（Leber's Hereditary Optic Neuropathy，LHON）是一种主要累及青年男性，导致双眼快速无痛性视力减退的母系遗传性眼病。线粒体DNA(mitochondria DNA，mtDNA)突变是该病的分子致病基础之一。线粒体ND4基因和ND6基因是与LHON相关的突变热点区域。
　　本研究在全国范围内共收集无血缘关系LHON汉族家系1218个，对收集的1218例先证者及316名正常对照者ND4基因突变筛查显示，ND4基因上共存在149个变异位点，携带已知的m.11253T＞C、m.11778G＞A和m.11696G＞A突变位点家系共466个，占LHON总家系的38.26％，其中携带m.11778G＞A突变位点的家系440个，占36.12％。此外我们还发现10个携带可能有意义突变位点的家系，占LHON总家系的0.82％。
　　我们对其中一个携带m.11778G＞A突变位点的5代111人的大家系进行了详细的眼科学、遗传学和生化功能评估。17名母系成员中6名患者表现出全视盘或部分视盘苍白，11名携带者中7名母系成员眼底正常，而4名携带者(V-6，V-7，V-8和V-9)眼底血管迂曲。光学相干断层扫描(OCT)检查显示患者组视网膜神经纤维层（RNFL）厚度在各个象限均变薄，携带者RNFL厚度在颞侧象限较正常组变厚。值得一提的是，携带者V-6的RNFL厚度在颞上侧象限变薄，V-8的RNFL厚度在鼻侧，鼻上侧和颞上侧象限均变薄。对该家系5名患者和5名携带者及具有相同单体型的4名正常对照者建立永生化淋巴细胞系，患者组和携带者的线粒体膜电位分别是对照者组的61.15％和66.46％。在2-DG和丙酮酸存在情况下，患者组氧化磷酸化产生ATP是正常组的49.09％，而携带者组较正常组下降35.08％。此外，患者组和携带组的ROS水平较正常组分别增加85％和56％。患者组和携带者组ND4，ND1，ND5，ND6，NDUFS1和NDUFB8蛋白表达量较正常对照组明显降低。
　　ND6基因突变筛查显示，ND6基因上共存在92个变异位点，包括29个错义突变位点（9个未报道突变和20个已报道突变）和63个沉默突变位点，94个携带ND6基因14484T＞C，14502T＞C，14459G＞A突变位点的家系占总家系的7.7％，其中m.14484T＞C突变位点家系占4.4％。此外，12个携带可能有意义突变位点的家系占总家系的1.1％，因此，106个携带ND6基因突变位点的家系占总家系的8.7％。线粒体单体型M9，M10，M11和H2在患者中的比例大于正常对照者。
　　我们对单独携带m.14502T＞C突变位点的患者，单独携带m.11778G＞A突变位点的患者，同时携带m.14502T＞C突变位点和m.11778G＞A突变位点的患者和正常对照者建立永生化淋巴细胞系和转线粒体细胞系(Cybrids)。研究发现，单独携带m.14502T＞C突变位点的Cybrids其基础OCR值、ATP偶联OCR值及最大OCR值较正常组分别下降18.3％，15.2％和33.7％，而同时携带m.14502T＞C突变位点和m.11778G＞A突变位点的Cybrids下降程度更明显。线粒体膜电位和氧化磷酸化产生的ATP在同时携带m.14502T＞C突变位点和m.11778G＞A突变位点的Cybrids明显降低。ROS水平在携带双突变组明显高于单独携带m.14502T＞C突变位点组及单独携带m.11778G＞A突变位点组。这些结果证实，m.14502T＞C突变位点可能是与LHON相关的继发突变位点，本身可引起线粒体功能下降，也可协同原发突变，加重线粒体的损伤。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 LHON的流行病学

1．2 LHON的临床表现

1．2．1 临床前期

1．2．2 急性期

1．2．3 萎缩期

1．2．4 视力恢复期

1．2．5 伴随特征

1．3 LHON的发病机制

1．3．1 线粒体的特征

1．3．2 LHON相关的mtDNA原发突变

1．3．3 LHON相关的mtDNA继发突变

1．3．4 影响LHON发病的其他因素

1．4 线粒体在视神经中的作用

1．5 LHON诊断与鉴别诊断

1．5．1 临床诊断

1．5．2 辅助诊断

1．5．3 家族史调查

1．5．4 分子遗传学检测

1．5．5 生化功能分析

1．5．6 LHON的鉴别诊断

1．6 LHON的治疗与遗传咨询

1．7 本课题研究思路

第二章 实验材料和实验方法

2．1 研究对象

2．1．1 研究对象来源和收集

2．1．2 LHON病例纳入标准

2．2 实验材料

2．2．1 血样、DNA和细胞株

2．2．2 主要试剂

2．3 实验仪器

2．4 眼科学检查方法

2．5 分子生物学相关实验和方法

2．5．1 基因组DNA的提取

2．5．2 线粒体DNA序列测定

2．5．3 STR基因型分析

2．5．4 荧光定量PCR

2．6 细胞相关实验和方法

2．6．1 细胞培养

2．6．2 永生化淋巴细胞系的建立

2．6．3 转线粒体细胞系的建立

2．6．4 线粒体膜电位检测

2．6．5 细胞氧耗速率测定

2．6．6 细胞ATP产量测定

2．6．7 细胞ROS检测

2．7 蛋白相关实验和方法

2．7．1 蛋白的提取

2．7．2 蛋白浓度的测定

2．7．3 Westen Blot蛋白定量检测

第三章 实验结果和实验讨论

3．1 样本的收集和原发突变位点的检测

3．1．1 LHON家系和正常对照者收集

3．1．2 原发突变位点的筛查

3．1．3 分析和讨论

3．2 线粒体ND4基因突变频谱分析

3．2．1 线粒体ND4基因突变位点评估

3．2．2 携带ND4基因可能突变位点家系的临床和遗传学分析

3．2．3 携带m．11696G>A突变家系的临床和遗传学分析

3．2．4 携带m．11778G>A突变先证者的遗传学分析

3．2．5 分析和讨论

3．3 一个携带ND4基因11778G>A突变大家系的临床、遗传和生化功能分析

3．3．1 携带m．11778G>A突变家系的临床资料分析

3．3．2 家系母系成员眼科学检查和统计学分析

3．3．3 携带111．11778G>A突变家系永生化淋巴细胞系生化功能检测

3．3．4 分析和讨论

3．4 线粒体ND6基因突变分析

3．4．1 线粒体ND6基因突变频谱绘制

3．4．2 携带ND6基因可能突变位点家系的临床和遗传学检测

3．4．3 携带m．14484T>C突变的先证者遗传学检测

3．4．4 携带m．14502T>C突变的家系和先证者临床和遗传学检测

3．4．5 分析和讨论

3．5 线粒体ND6基因一个继发突变位点m．14502T>C的评估

3．5．1 永生化淋巴细胞系和转线粒体细胞系的构建

3．5．2 转线粒体细胞系的线粒体功能检测

3．5．3 分析和讨论

第四章 本课题研究意义

第五章 研究中存在的问题

参考文献

附录

攻读博士学位期间主要研究成果

致谢