OsAUX/LAX家族表达模式及OsAUX1在水稻根系发育中的功能研究

摘要

植物根系是固定植株，吸收运输水分和养分，合成及储藏营养物质的重要器官。生长素浓度的不同影响根系发育，而生长素浓度梯度的维持依赖于极性运输。迄今已经报道了三个基因家族参与生长素的极性运输:输入载体AUX1/LAX(auxin resistant1/like AUX1)家族、输出载体PIN(pin-formed)家族和ABCB/MDR/PGP(ATP binding cassette B/Multidrug-resistance/p-glycoprotein)。拟南芥中，P/N家族已有广泛研究，但PGP和AUX家族的研究相对滞后。同源性比对，水稻中有5个AUX1类似基因，对其生物学功能报道甚少。通过生物信息学分析了水稻OsAUX/LAX家族基因结构和蛋白结构，构建OsA UX/LAX启动子融合报告基因葡（萄）糖苷酸酶(β-glueuronidase，GUS)，研究了OsA UX/LAX家族的表达模式，以OsAUX1的突变体和过表达为材料，研究OsA UX1在主根和根毛发育中的生物学功能。主要结果概述如下:
　　(1)OsAUX/LAX家族中基因结构有差异。OsA UX1、OsA UX2、OsA UX3、OsAUX4有5-7个外显子，OsA UX5只有2个外显子，而拟南芥AtA UX/LAX有6-7个外显子。OsA UX/LAX家族氨基酸序列的相似性为70.58％～84.15％，与拟南芥的四个蛋白比较相似，表明在生长素输入方面功能保守。
　　(2)明确了OsAUX/LAX家族的蛋白结构和定位。该家族都含有9～11个跨膜结构，验证OsA UX/LAX家族主要定位在细胞膜上。
　　(3)OsAUX/LAX家族成员的表达模式有着各自的特异性。OsAUX1表达模式与AtAUX1类似，呈现组成型表达。在韧皮部、中柱、侧根根冠、根尖表皮细胞、伸长区细胞均有表达。OsAUX3只在侧根原基，靠近基部的表皮细胞中表达。OsAUX2，OsAUX4和OsAUX5与AtLAX2进化保守，它们在初生根中的表达相似，在侧根表达有差异。在地上部，这5个基因的表达相似，都在茎的维管、叶肉细胞、颖壳、雌蕊和雄蕊中表达。OsAUX/LAX基因的表达受IAA、2，4-D、盐和镉胁迫诱导。
　　(4)敲除突变体——osaux1表现对NAA无抗性，但对IAA和2，4-D有抗性。osaux1的主根在正常培养条件下比野生型长30％，OsAUX1超表达株系主根比野生型短30％，osaux1侧根密度减少，根毛长度变短。用外源高浓度生长素及极性运输载体抑制剂处理后发现，osaux1对IAA，2，4-D，NPA不敏感，而OsAUX1超表达株系对它们敏感;此外，osaux1株系表现向地性缺失。
　　(5)OsAUX1在根毛发育中起作用。用IAA和2，4-D处理后osaux1株系的根毛不能回复到野生型长度，而NAA可以恢复其根毛长度。OsAUX1p::OsA UX1:GFP和OsA UX1p::GUS转基因水稻表明OsAUX1在正在发育的根毛中表达。
　　(6)该突变体对镉胁迫敏感。镉处理下osaux1突变体主根变短，侧根严重减少，根毛几乎不长，其原因可能是内源生长素、细胞周期和ROS共同作用的结果。
　　本研究为生长素在水稻根系发育过程中分子机制提供了新的视角，为水稻根系改良提供理论和实践依据。

目录

论文说明

声明

致谢

摘要

缩略语表

第一章 文献综述

1．1 生长素的发现、种类及其化学结构

1．2 生长素的合成与代谢

1．3 生长素的分布

1．4 生长素的运输

1．4．1 输入载体AUX／LAX家族

1．4．2 输出载体PIN家族

1．4．3 ABCB／MDR／PGP蛋白家族

1．5 生长素对植物根系发育的影响

1．5．1 生长素对植物主根发育的影响

1．5．2 生长素对植物侧根发育的影响

1．5．3 生长素对植物根毛发育的影响

1．6 研究目的和意义

第二章 OsAUX／LAX家族生物信息学分析及亚细胞定位

2．1 引言

2．2 材料与方法

2．2．1 OsAUX／LAX家族基因结构、蛋白相似性、进化树分析

2．2．2 跨膜结构分析及糖基化位点预测

2．2．3 GFP融合表达载体构建

2．2．4 烟草及水稻原生质体转化

2．3 结果与分析

2．3．1 OsAUX／LAX家族基因结构、蛋白相似性、进化树分析

2．3．2 水稻OsAUX／LAX家族跨膜结构分析和亚细胞定位

2．4 讨论

2．5 本章小结

第三章 OsAUX／LAX家族的表达分析

3．1 引言

3．2 材料与方法

3．2．1 材料

3．2．2 方法

3．3 结果和分析

3．3．1 GUS染色和荧光定量PCR分析OsAUX／LAX家族成员表达模式

3．3．2 激素和胁迫对OsAUX／LAX家族成员表达分析

3．4 讨论

3．5 本章小结

第四章 OsAUX1突变体、超表达材料的获得鉴定及表型分析

4．1 引言

4．2 材料与方法

4．2．1 材料

4．2．2 OsAUX1超表达载体构建及转基因鉴定

4．2．3 osaux1突交体鉴定

4．2．4 激素处理和表型观察

4．3 结果与分析

4．3．1 超表达材料和突变体的鉴定及结果分析

4．3．2 超表达株系和突交体的表型分析

4．4 讨论

4．5 本章小结

第五章 OsAUX1在根毛发育和镉胁迫响应中的功能

5．1 引言

5．2 材料方法

5．2．1 材料

5．2．2 方法

5．3 结果分析

5．3．1 osaux1突交体根毛表型分析

5．3．2 OsAUX1在镉胁迫中的表达分析

5．3．3 osaux1突交体在镉胁迫中的表型分析

5．3．4 osaux1突交体在镉胁迫中的IAA含量分析

5．3．5 IAA处理和镉处理下野生型和突交体的OsCyCB1；1表达

5．3．6 镉处理下野生型和突交体的镉含量和分布

5．3．7 镉处理下野生型和突变体的超氧阴离子、过氧化氢、硫代巴比妥酸反应物质和细胞死亡测定

5．4 讨论

5．5 本章小结

第六章 全文总结与展望

6．1 全文总结

6．2 本研究创新点

6．3 展望

6．3．1 双突变体的获得和表型的鉴定

6．3．2 OsAUX1可作为一个根毛发育的marker基因

6．3．3 寻找上游和互作蛋白

6．3．4 蛋白修饰和囊泡运输研究

参考文献

附录

个人简历

攻博期间发表的论文