人参皂苷Rg1和Re通过TLR4通路发挥免疫调节及抗内毒素作用

摘要

人参皂苷(Ginsenoside)作为人参（Panax ginseng C.A.Meyer）的主要活性成分之一，具有免疫调节功能。人参皂苷Rg1和Re是人参中含量较多的两种物质，同属于原人参三醇型皂苷。前期研究发现，Rg1和Re均具有免疫调节作用，Toll样受体4(Toll-like receptor4，TLR4)是免疫调节的一个重要受体，也是细菌内毒素(LPS)产生急性炎症作用的一个关键受体。革兰氏阴性菌感染机体后，细菌死亡，释放出LPS结合到TLR4迅速激活下游的信号通路，过量表达炎症介质、损害组织器官、出现急性败血症，甚至败血性休克，危机生命。本文首先研究Rg1和Re的免疫调节作用机理，发现Rg1和Re通过TLR4途径发挥免疫调节作用;在此基础上，探讨Rg1和Re干扰LPS结合巨噬细胞受体上的TLR4释放炎症介质，并研究Rg1和Re抗内毒素以及抗大肠杆菌感染作用。
　　1.Rg1和Re的免疫佐剂作用与TLR4信号通路关系的研究
　　目的:了解Rg1和Re的免疫佐剂作用与TLR4信号通路关系。方法:1）将Rg1和Re分别与模式抗原卵清蛋白(Ovalbumin，OVA)免疫TLR4突变型小鼠(C3H/HeJ)和其野生型小鼠后，检测抗原特异性免疫反应;2）用抗TLR4抗体封闭RAW-Blue细胞的TLR4，然后用LPS刺激细胞，比较封闭前后细胞上清中碱性磷酸酶的分泌情况，间接反映细胞内核转录因子-κB(Nucleartranscription factor-κB，NF-κB)的活化情况;3）用Rg1分别刺激来自TLR4突变型和野生型小鼠的巨噬细胞，用Western blot检测胞内NF-κB的磷酸化情况;4）应用分子对接技术模拟LPS、Rg1和Re与TLR4-MD-2分子的相互作用。
　　结果:1）Rg1和Re在野生型小鼠(C3H/HeB)体内能够，但在TLR4突变小鼠(C3H/HeJ)体内不能够，显著提高抗OVA特异性IgG抗体水平、脾脏淋巴细胞增殖反应，白介素(IL)-12、干扰素(IFN)-γ、白介素(IL)-4和白介素(IL)-10等细胞因子和转录因子的mRNA表达水平;2）Rg1和Re能够激活小鼠巨噬细胞系中NF-κB，但是用抗体封闭细胞膜上的TLR4明显抑制Re对NF-κB的活化作用，而不能抑制Rg1的活化作用;3）Rg1在正常小鼠腹腔巨噬细胞中能够迅速激活NF-κB亚基发生磷酸化，然而在TLR4突变小鼠巨噬细胞中则不能;4）推测Re、Rg1作用方式和LPS类似，在TLR4和MD-2分子之间起到了“桥梁”作用，促进了它们的二聚化。Rg1和Re与TLR4/MD-2分子之间亲和力分别为（-8.6和-8.4），明显弱于LPS和TLR4/MD-2之间的亲和力(-21.5)。2.Rg1和Re影响LPS作用通路的研究
　　目的:探究Rg1和Re对LPS作用的影响。方法:1）分别用50μg/ml Rg1和Re加入RAW264.7细胞中，孵育2和6h，用免疫荧光技术在显微镜下观察这两种人参皂苷在细胞内外的分布;2）分别用10，30，50，70μg/ml的Rg1和Re加入RAW264.7细胞中，孵育1h，随后Alexa fluor594-LPS以终浓度10μg/ml避光加入，刺激1h后，用免疫荧光技术在共聚焦显微镜下观察这两种人参皂苷对LPS结合TLR4的影响;3）分别用10，30，50，70μg/ml的Rg1和Re于LPS刺激前或后1h加入RAW-Blue细胞中，孵育20 h，检测细胞上清中碱性磷酸酶的分泌情况，间接反映细胞内NF-κB的活化情况;4）分别用50μg/ml的Rg1和Re提前加入RAW264.7细胞中，孵育1h后，加入LPS刺激20 h，检测白介素(IL)-1β、肿瘤坏死因子(TNF)-α和白介素(IL)-6以及一氧化氮(NO)和前列腺素E2(PGE2)的表达水平。结果:1）Rg1不仅分布在细胞膜上，还能够穿过胞膜，广泛地分布到胞质中;而Re不能穿过胞膜，只能分布在细胞膜上;2）Rg1和Re在体外先于LPS刺激细胞，能够强烈地下调LPS介导的信号通路，包括阻止LPS结合TLR4，抑制LPS诱导NF-κB的活化以及多种促炎性细胞因子（IL-1β、TNF-α和IL-6）和炎症介质（NO和PGE2）的表达。但是，当Rg1和Re在LPS刺激之后1h加入却没有明显的下调作用。
　　3.Rg1和Re在LPS染毒动物模型的保护作用
　　目的:观察Rg1和Re对LPS染毒动物的保护作用。方法:1）30只雄性SD大鼠随机分为5组，每组6只，分别依次尾静脉注射人参皂苷Rg1(1 mg/kg)、Re(1 mg/kg)和TAK-242(1 mg/kg)和生理盐水。15 min后除空白对照组外其余各组均攻静脉注射LPS。LPS染毒后检测各组动物的体温，血液白细胞数以及血清中促炎性细胞因子;2）Rg1和Re的预防性保护试验中，各自设70只BALB/c小鼠随机分为7组，每组10只，分别3次皮下注射Rg1/Re(2.5、5、10、20 mg/kg)和TAK-242(5 mg/kg)，间隔30 min; LPS单独注射组和空白对照组分别皮下注射生理盐水。最后一次皮下注射结束15 min后，除空白组外，各组腹腔注射LPS(20 mg/kg)。观察小鼠的行为、状态和死亡情况;3）将BALB/c小鼠随机分为5组，每组10只，除空白组外，各组均腹腔注射LPS(20 mg/kg)。15 min后除空白组和LPS单独染毒组外，各组分别3次皮下注射Rg1（10 mg/kg）、Re(20 mg/kg)和TAK-242(5 mg/kg)，间隔30 min; LPS单独注射组和空白组皮下注射生理盐水。观察小鼠的行为、状态和死亡情况;4）将45只BALB/c小鼠随机分为5组，每组9只，组1-3分别3次皮下注射100μlRg1(10 mg/kg)、Re(20 mg/kg)和TAK-242(5 mg/kg)，间隔30 min。于最后一次注射结束15 min后，各组均腹腔注射20 mg/kg LPS。组5在染毒15 min后3次皮下注射Rg1(10mg/kg)，间隔30 min。在感染后各个时间点(4，8，12 h)分别从每组取3只小鼠，CO2安乐死后，进行血液白细胞计数、检测血清细胞因子和炎症介质的表达水平。另外取5只未经任何处理的小鼠，安乐死后取样作为0h的样品。结果:1）Rg1和Re在LPS染毒大鼠前静脉注射能够显著缓解LPS引起的发热、白细胞数量增加和血清促炎性细胞因子（IL-1β、TNF-α和IL-6)和炎症介质(NO和PGE2)的高水平表达;2）在小鼠内毒素休克模型中，Rg1和Re在染毒前给药三次能够有效缓解LPS导致的白细胞特别是中性粒细胞数量的减少以及各种炎症因子(IL-1β、TNF-α和IL-6、趋化因子KC、巨噬细胞炎性蛋白-2、NO和PGE2)的过量表达，并且显著提高小鼠的存活率。Rg1在染毒后给药三次仍然能够有效缓解LPS导致的炎症反应，并使小鼠的存活率从30％提高至90％，但是Re在染毒后给药对小鼠没有保护作用。
　　4.Rg1联合PMB给药对大肠杆菌感染家兔的治疗作用
　　目的:观察Rg1和低剂量的多粘菌素B(Polymyxin B，PMB)联合给药对大肠杆菌感染的家兔的保护作用。方法:将20只新西兰大白兔随机分成4组，每组5只。大肠杆菌颈部皮下感染(1×109 CFU/kg)后立即分别静脉注射（左耳）Rg1、PMB和Rg1+PMB;对照组在感染后注射等容量的生理盐水。然后检测体温，血液中细菌，血清中LPS含量，血清促炎性细胞因子和炎症介质的表达水平。结果:联合给药能够显著降低血液中的细菌数和LPS含量，缓解家兔因感染所致的发热、白细胞包括中性粒细胞和淋巴细胞的数量变化以及血清中各种促炎性细胞因子（IL-1β、TNF-α和IL-6）的高水平表达。而低剂量PMB单独给药组的抗炎作用持续时间很短，只在感染后前8个小时能够缓解各种炎症反应，在8个小时之后无抗炎作用。另外，单独的Rg1给药对大肠杆菌感染无治疗作用。
　　因此，本研究的结果表明人参皂苷Rg1和Re是通过TLR4信号通路来发挥免疫调节作用;Rg1和Re与LPS竞争，干扰LPS与TLR4受体的结合，产生抗LPS作用;Rg1能和细胞内外TLR4结合，而Re仅和胞外TLR4结合;Rg1对LPS引起的大鼠和小鼠毒血症具有预防和治疗效果;Rg1和安全剂量的PMB联合给药能有效缓解家兔感染致病性大肠杆菌。因此人参皂苷Rg1作为防治革兰氏阴性菌感染的药物值得进一步研究。

目录

声明

摘要

图目录

表目录

英文缩写注释

第一部分 文献综述

第一章 人参皂苷的分布、结构和种类的研究进展

1．人参皂苷在人参各部位中的分布情况

2．人参皂苷的结构和种类

第二章 人参皂苷对天然免疫的调节作用

1．人参皂苷对巨噬细胞(MΦ)的作用

2．人参皂苷对树突状细胞(DC)的作用

3．人参皂苷对自然杀伤性细胞(NK)的作用

4．人参皂苷与Toll样受体(TLR)

第三章 人参皂苷对适应性免疫的调节作用

1．体液免疫应答

2．细胞介导的免疫应答

第四章 人参皂苷在临床上的应用

1．人参皂苷的免疫佐剂作用

2．人参皂苷的抗炎作用

本研究的目的和意义

第二部分 试验研究

第一章Rg1和Re的免疫佐剂作用与TLR4信号通路关系的研究

1．材料

2．方法

3．结果

4．讨论

第二章 Rg1和Re影响LPS作用通路的研究

1．材料

2．方法

3．结果

4．讨论

第三章 Rg1和Re在内毒素染毒动物模型中的防治作用

1．材料

2．方法

3．结果

4．讨论

第四章 Rg1联合PMB给药对大肠杆菌感染家兔的治疗作用

1．材料

2．方法

3．结果

4．讨论

第五章 综合讨论

结论

创新点

研究展望

参考文献

附录

作者简介

致谢