家禽EPCs分离培养及HGF对炎症环境下EPCs功能的影响

摘要

内皮祖细胞(EPCs)是最近在哺乳动物血液循环中发现的一群表达CD133、CD31、CD34和VEGFR-2的细胞。越来越多的证据表明内皮祖细胞在血管损伤的修复和病理学的新血管形成过程中起重要作用。内皮祖细胞失衡与许多心血管疾病有关，包括人类的肺动脉高压(PAH)。丛状病变是PAH病情恶化的特征，指症为不良预后。最近的研究指出患有严重PAH的病人的血液中内皮祖细胞增多，带有丛状病变的EPCs来源于血液循环中的EPCs，说明这些细胞与血管再生有关。然而，其中的机制尚不明确。鸡的PAH与人类的病情有部分相似之处，包括管壁内侧肥厚，内膜增殖，及肺血管中闭合的丛状病变，所以它被认为是研究人类肺动脉高压的理想模型。同时，我们发现在丛状病变中有长期的炎症反应和HGF的增长性表达，然而其中的机理尚未完全清晰。丛状病变表现为管腔中出现圆形或裂隙状的区域，主要被内皮样细胞填充，也就是EPCs。丛状病变区域被T淋巴细胞、B淋巴细胞和巨噬细胞等慢性炎症细胞包围。另外，炎症主要集中于动脉病变附近。前期的研究表明由淋巴细胞和巨噬细胞分泌的细胞因子TNF-α，可以降低细胞增殖、细胞迁移、细胞黏附和EPCs的成小管能力。我们假设与淋巴细胞的共培养可以导致EPCs的功能紊乱，这可以解释丛状病变中的EPCs维持未分化状态不发育为内皮细胞。
　　本研究的主要目的是研究禽类中EPCs的特点，研究HGF在炎症期间对EPC功能的影响，特别是EPCs对PAH中丛状病变产生的影响。目前还没有此类研究对禽类的骨髓进行培养，研究其表型特征，比较外周血单核细胞和骨髓单核细胞体外培养的血管再生能力和病理情况下HGF对EPCs的作用。我们主要做了三个方面的实验:
　　实验1比较鸡骨髓诱导的单核细胞在EGM-2和DMEM培养基中的分化特征，用于比较诱导自这两种培养基的内皮祖细胞有怎样的生物性状差异，同时衡量这两种培养基对体外培养来自鸡骨髓的具有血管再生潜能的内皮祖细胞的效价。骨髓诱导的单核细胞始终为纺锤样结构，表达CD133、CD31和VEGFR-2。Dil-ac-LDL/FITC-UEA-1双阳性细胞实验显示组间无显著差异。培养于EGM-2的BMMNCs能形成管状结构，然而培养于DMEM培养基的细胞则不能形成这样的结构。有趣的是，我们发现EGM-2更利于EPCs的诱导增殖因为它能使细胞离体培养后增殖，有利于内皮分化，迁移，提高细胞体外血管再生能力。而DMEM有利于细胞早期形态分化，但不支持内皮分化，迁移及血管再生能力。
　　通过观察两种培养基对鸡骨髓诱导的内皮祖细胞，我们更进一步观察到来自快速生长型肉鸡骨髓和外周血分离诱导的内皮祖细胞表型和体外培养血管再生能力有差异。PBMNCs具有特征性的内皮祖细胞形态，最初出现的纺锤样结构，而后呈现为铺路石状，而BMMNCs自始至终都为纺锤状结构。诱导自两种来源的细胞均表达CD133、CD31和VEGFR-2，而PBMNCs诱导的细胞CD133表达量降低。而Dil— ac-LDL/lectin双阳性细胞统计结果显示两组没有差异。诱导自BMMNCs的细胞具有成脂细胞及成骨细胞能力。诱导自PBMNC的细胞在Matrigel中培养能形成管状网络结构，但BMMNC分离的细胞只形成了少量管状结构。实验结果表明自BMMN分离的细胞并不是”真”的EPC，这与前期在哺乳类动物上的发现骨髓可能不是EPCs最好的分离来源相一致。
　　最后，我们研究了肝细胞生长因子(HGF)对暴露于淋巴细胞的EPCs功能的影响。通过内皮细胞特异的ac-LDL吞噬和lectin结合实验来确定细胞为EPCs。最后，用HGF/淋巴细胞单独或联合刺激EPCs，将EPCs用0.25％的trypsin-EDTA消化后用于实验。采用鸡外周血中暴露于淋巴细胞的EPCs来检测内源的HGF。5-7天时纺锤样细胞形成小集落簇在第10天左右分化成为铺路石样的单层细胞。与淋巴细胞共培养的EPCs的增殖性较普通培养没有明显差异，说明仅与淋巴细胞共培养不会影响内皮祖细胞的增殖。有趣的是，当HGF对EPCs的作用浓度为5ng/ml和10ng/ml时，EPCs的增殖被显著抑制，但当用20ng/ml时，细胞增殖显著高。在普通培养基中约17.2％的EPCs凋亡，加入了5、10、20ng/ml的HGF能抑制细胞的死亡。当EPC与淋巴细胞共培养时也可以看到细胞凋亡显著下降，提示HGF和淋巴细胞能显著抑制EPC的凋亡。将HGF与淋巴细胞联合刺激EPC能更有效的抑制它的凋亡。5ng/ml HGF对暴露于淋巴细胞的EPCs的凋亡有显著的抑制作用。高浓度(20ng/ml)的HGF显著提高细胞迁移能力而对细胞增殖有相同的作用。总而言之，暴露于淋巴细胞能显著提高细胞的迁移能力。同样的，低浓度HGF(5ng/ml)单独或联合淋巴细胞均显著提高细胞迁移能力，提示HGF和淋巴细胞在最低浓度是也有协同作用。量，动员能力，减少细胞死亡，HGF能明显抑制细胞凋亡，从而提高暴露于淋巴细胞的EPCs的细胞存活能力，所以HGF能提高EPCs的数量，减少细胞死亡，促进在血管损伤部位和丛状病变部位管状结构的形成。

目录

声明

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Acknowledgment

Contents

List of Figures

ABBRVIATIONS LIST

摘要

Abstract

Chapter 1 Literature review

1．1 Brief History

1．2．Functional capabilities of endothelial progenitors cells(EPCs)

1．2．1．EPC cell-cell interactions

1．2．2．Mobilization and recruitment of EPCs

1．2．3．Homing，migration，invasion，proliferation and differentiation of EPCs

1．2．4．Angiogenesis

1．3．Isolation of EPCs：EPCs can be isolated mainly from blood or bone marrow

1．3．1 Isolation of EPCs from bone marrow

1．3．2 Isolation of EPCs from the blood

1．3．3 Isolation of EPCs from umbilical cord

Chapter 2 Differential characteristics of chicken bone marrow derived monocyte cultured on EGM-2 and DMEM medim：An in vitro comparative study

2．1．摘要

2．1．Abstract

2．2．Introduction

2．3 Materials and methods

2．3．1 Mononuclear cells preparation

2．3．2 Buffy Coat

2．3．3 Cell culture

2．3．4 Cell characterization

2．3．5 Quantitative real-time Polymerase chain reaction analysis(q PCR)

2．3．6．Dil-ac-LDL and FITC-UEA-1 uptake

2．3．7．Cell migration

2．3．8．In vitro tube formation

2．3．9．Statistical analysis

2．4 Results

2．4．1 Morphology of cells derived from chicken bone marrow(Bill)

2．4．2 Quantitative Polymerase Chain Reaction(qPCR)

2．4．3 Uptake of DiI-ac-LDL and binding of lectin(Double staining capacity of cell) did not differ

2．4．4 EGM2 increased migration capacity of chicken BMMNCs cells

2．4．5 BMMNC-derived cells can also form tube-like structure in vitro

2．5 Discussion

Chapter 3 Differential characteristics and in vitro angiogenesis of bone marrow and peripheral blood-derived endothelial progenitor cells

3．1 摘要

3．1 Abstract

3．2 Introduction

3．3 Materials and Methods

3．3．1 Cell culture

3．3．2 Cell survival

3．3．3 Reverse transcription(RT)-PCR

3．3．4 Dil-ac-LDL and lectin staining

3．3．5 Adipogenic and osteogenic differentiation

3．3．6 Statistical analysis

3．4 Results

3．4．1．Different morphology of cells derived from BMMNCs and PBMNCs

3．4．2 Proliferation of BMMNC-and PBMNC-derived cells

3．4．3 Both BMMNC-and PBMNC-derived cells expressed endothelia linage cell markers

3．4．4 The number of Dil-ac-LDL／lectin

3．4．5 Differentiation of BMMNCs into adipocytes and osteoblasts

3．4．6 BMMNC-and PBMNC-derived cells displayed similar capacity of migration

3．4．7 BMMNC-derived cells had poor ability to form tube-like strueture in vitro

3．5 Discussion

Chapter 4 In vitro effect of hepatocyte growth factor on the functionality of endothelial progenitor cells exposed to lymphocytes

4．1 摘要

4．1．Abstract

4．2 Introduction

4．3．Material and methods

4．3．1．Preparation of EPCs

4．3．2．Characterization of EPCs

4．3．3．Preparation of lymphocytes

4．3．4．cell treatments

4．3．5．Methyl Thiazolyl Tetrazolium(MTT)Assay

4．3．6．Flow cytometric analysis of cell apoptosis

4．3．7．Migration assay

4．3．8．In vitro tubular formation assay

4．3．9．Statistical analyses

4．4．Result

4．4．1．Characterization of PBMNC-derived EPCs

4．4．2．Effect of HGF on EPC proliferation in the presence of lymphocyte

4．4．3．Cell apoptosis

4．4．4 Migration assay

4．4．5 Tube formation Assay

4．5．Discussion

General conclusions

Novelity andfuture prospects

References

List of Publications