气道炎症性疾病中炎症小体调控IL-17A+γδT细胞/中性粒细胞的分子机制研究

摘要

背景：
　　支气管哮喘是一种复杂的气炎症反应综合征，以气道阻塞、气道炎症和气道高反应性为特点。难治性哮喘以中性粒细胞气道炎症为主。臭氧暴露是诱导中性粒细胞气道炎症的方法，但是其具体机制尚未明确。此外，臭氧暴露还可以导致哮喘患者急性发作。臭氧介导的气道炎症的特点是中性粒细胞浸润、气道高反应性以及前炎症因子的释放，如TNFα、IL-6、MIP-21-4。
　　目前的很多研究表明，T细胞在哮喘的发生和发展过程中发挥了重要的作用。T细胞可以通过产生细胞因子介导炎症细胞聚集和气道高反应性的发生。Th17细胞是近年来发现的不同于Th1和Th2细胞的另一种CD4+T细胞的新亚型，有调查发现哮喘患者体内IL-17水平升高。IL-17是一种促炎因子，可以调节中性粒细胞反应。临床研究发现，IL-17A与IL-17F的表达水平与哮喘病人的病情严重程度呈正相关，重度哮喘患者血清中IL-17的水平较轻、中度患者明显增高，激素抵抗的重症哮喘患者IL-17A的水平与气道中性粒细胞数量呈正相关5-8。
　　炎症小体9-11是由胞浆内多蛋白复合物，是天然免疫系统的重要组成部分。炎症小体能够识别PAMPs或者宿主来源的DAMPs，招募和激活促炎症蛋白酶Caspase-19。活化的Caspase-1切割IL-1β和IL-18的前体，产生相应的成熟细胞因子9-11。IL-1β是IL-1家族的成员之一12，作为一种重要的炎症调节因子参与多种疾病的发生发展。炎症小体参与很多与IL-1β相关的疾病如cryopyrin-associatedperiodic综合征、肠炎以及2型糖尿病13。IL-1β在抗感染免疫与慢性炎症相关的组织损伤中都起重要作用。IL-1β联合IL-6以及IL-23可通过促进转录因子IFR4和RORγt的表达促进Th17分化14。Caspase-1和IL-1信号通路都与臭氧介导的中性粒细胞气道炎症有关15，但其具体机制未明。
　　γδT细胞是一种T细胞的亚群，表达TCRγδ，是区分于与αβT细胞的另一种T细胞亚型16-18。γδT细胞属于非MHC限制性免疫细胞，可不通过抗原识别过程直接识别抗原，但识别范围较窄。外周血的γδT细胞占总T细胞数量的5％以下。组织γδT细胞主要分部在肺、皮肤、尿道以及小肠的粘膜中。γδT细胞参与了很多生物学过程如感染性疾病，自身免疫性疾病，及抗肿瘤免疫19,20。分泌IL-17的γδT细胞在肿瘤生长21及肾损伤22中都起关键调节作用23。在COPD24和过敏性疾病患者25体内，γδT细胞比例增高。已有研究报道，γδT细胞参与臭氧诱导的中性粒细胞气道炎症，但其具体机制未明。
　　由于炎症小体-IL-1信号通路及IL-17均在中性粒细胞气道炎症中起关键调节作用，本课题假设臭氧可以活化炎症小体，促进成熟型IL-1β产生。微环境中的IL-1β可以活化γδT细胞分泌IL-17，最终导致中性粒细胞气道炎症。本研究在臭氧诱导的中性粒细胞气道炎症模型中，通过整体模型、体外细胞培养等方法，阐明炎症小体在哮喘发病中对IL-17+γδT细胞/中性粒细胞炎症调控的关键分子机制，为开发研究治疗气道慢性炎症性疾病新的药物靶点提供理论依据。
　　第一部分 臭氧诱导中性粒细胞气道炎症和IL-17A+γδT细胞
　　目的:建立臭氧诱导的中性粒细胞气道炎症模型，观察IL-17A的变化，寻找IL-17A的分泌来源。
　　方法:C57/BL6小鼠（雌性，6-8周）随机分为2组，每组5-7只小鼠。分别予以空气(Air)和臭氧(Ozone)暴露72小时，停止暴露后24小时处死小鼠。取小鼠BALF，进行细胞总数与细胞分类计数。Elisa方法测定肺组织炎症因子的表达。BCA法测定BALF蛋白浓度。病理切片HE染色观察气道炎症细胞浸润。提取肺组织淋巴细胞流式分析IL-17A+细胞的比例及其分泌来源。Il17a-/-小鼠臭氧暴露，观察其BALF炎症细胞、炎症因子及BALF总蛋白的表达。
　　结果:成功地构建了中性粒细胞气道炎症模型。小鼠BALF炎症细胞浸润明显增加，肺组织炎症因子IL-1β，IL-18，IL-17A，G-CSF, IP-10表达明显增加，BALF总蛋白水平明显增加。臭氧诱导气道炎症的同时伴随着IL-17A+淋巴细胞的增多。分泌IL-17A的淋巴细胞主要为TCRγδ+γδT细胞，而不是TCRβ+细胞。Il17a-/-小鼠阻断IL-17A可以有效地抑制臭氧诱导的中性粒细胞气道炎症和炎症因子分泌。
　　结论:臭氧暴露可以成功地诱导中性粒细胞气道炎症，这种气道炎症是由IL-17A和IL-17A+γδT细胞介导的。
　　第二部分 臭氧暴露活化炎症小体和IL-1R通路
　　目的:探讨臭氧介导中性粒细胞气道炎症的分子机制。
　　方法:C57/BL6小鼠分为Air组和Ozone组，Ozone组小鼠暴露与0.7 ppm臭氧环境中，分别在暴露中6h、12h、24h、72h，及暴露后6h、12h、24h、48h处死小鼠，观察肺组织匀浆中IL-1β动态变化。WT小鼠和Il1r1-/-小鼠分别分成Air组和Ozone组，Ozone组小鼠同时暴露与0.7 ppm臭氧环境中72小时，停止暴露后24小时处理小鼠。观察BALF细胞总数及细胞分类计数绝对值变化、Elisa方法检测肺组织匀浆中炎症小体相关炎症因子及其他炎症因子表达、流式细胞技术检测IL-17A+γδT细胞比例变化、RT-qPCR方法观察转录因子RORγt mRNA水平变化。从WT小鼠肺组织中提取原代巨噬细胞，MitoSOX方法检测线粒体超氧化、FAM-YVAD-FMK FLICA试剂检测caspase-1活化。提取小鼠巨噬细胞细胞质DNA，Q-PCR方法检测细胞质线粒体DNA相对表达量。Air组和Ozone组小鼠原代巨噬细胞进行体外培养，予以LPS或LPS联合ATP干预后，观察细胞培养上清IL-1β的表达。应用caspase-1抑制剂Ac-YVAD-cmk腹腔给药，观察小鼠BALF炎症细胞绝对值变化、Elisa方法检测肺组织炎症因子变化、流式细胞技术检测IL-17A+γδT细胞比例变化。
　　结果:臭氧暴露后，肺组织匀浆中的IL-1β缓慢升高，并且持续到停止暴露。Il1r1-/-小鼠较WT小鼠BALF细胞总数及巨噬细胞绝对值、淋巴细胞绝对值、中性粒细胞绝对值显著降低。肺组织炎症小体相关炎症因子IL-1β、IL-18显著降低。其他炎症因子G-CSF、IP-10显著降低。IL-17A+γδT细胞比例明显降低。转录因子RORγtmRNA水平明显降低。臭氧暴露后，肺组织巨噬细胞MitoSOX平均荧光强度明显增加、FAM-YVAD-FMK FLICA平均荧光强度明显增加、肺组织巨噬细胞线粒体DNA相对表达量明显增加。腹腔巨噬细胞体外培养上清中，不同干预方式Ozone组小鼠较Air组小鼠IL-1β水平均明显增加。Ac-YVAD-cmk腹腔给药小鼠较对照组小鼠淋巴细胞和中性粒细胞水平明显降低、炎症因子IL-1β、IL-17、KC、G-CSF、IP-10明显降低。IL-17A+γδT细胞比例明显降低。
　　结论:臭氧暴露导致线粒体超氧化和细胞质内线粒体DNA增多，通过caspase-1-IL-1-γδT细胞通路增加IL-17的分泌，最终导致中性粒细胞气道炎症。
　　第三部分 TFI保护臭氧介导中性粒细胞气道炎症
　　目的:探讨TNFR2-Fc-IL-1 ra(TFI)对臭氧介导中性粒细胞气道炎症的作用及机制。
　　方法:NS干预小鼠和TFI10mg、、50mg干预小鼠分别分成Air组和Ozone组，Ozone组小鼠同时暴露与0.7 ppm臭氧环境中72小时，停止暴露后24小时处理小鼠。观察不同浓度TFI干预小鼠BALF细胞总数及细胞分类计数绝对值变化。Elisa方法检测不同浓度TFI干预肺组织匀浆中炎症小体相关炎症因子及中性粒细胞趋化因子表达。Elisa方法检测不同浓度TFI干预肺组织匀浆中IL-17A的表达。流式细胞技术检测IL-17AγδT细胞比例变化。
　　结果:TFI干预小鼠较NS干预小鼠中性粒细胞绝对值显著降低。肺组织匀浆中炎症小体相关炎症因子IL-1β、IL-18显著降低，中性粒细胞趋化因子KC、MIP-2显著降低。肺组织匀浆中IL-17A表达明显降低。IL-17A+γδT细胞比例明显降低。
　　结论:TFI通过抑制caspase-14L-1-IL-17A+γδT细胞通路保护中性粒细胞气道炎症。

目录

声明

致谢

摘要

缩略语中英文对照

第一部分 臭氧诱导中性粒细胞气道炎症和IL-17A+γδT细胞

1．1 引言

1．2 材料和方法

1．3 结果

1．4 讨论

1．5 小结

第二部分 臭氧暴露活化炎症小体和IL-1R通路

2．1 引言

2．2 材料和方法

2．3 结果

2．4 讨论

2．5 小结

第三部分 TFI保护臭氧介导中性粒细胞气道炎症

3．1 引言

3．2 材料和方法

3．3 结果

3．4 讨论

3．5小结

结论

参考文献

综述

作者简历及在学期间的科研成果