小RNA深度测序在几种木本植物病毒鉴定中的应用

摘要

植物病毒是一类极为重要的病原物，对生产实践造成了很大的危害。林木在社会经济及生态环境中发挥着至关重要的作用，林木病毒有广泛的地理分布和寄主范围，对森林健康、生态环境有很大的潜在威胁。蕴藏在自然界木本植物中的病毒是个极大的未知数;同时，木本植物上的病毒往往很难通过摩擦接种的方式进行人工接种，利用传统方法检测木本植物病毒非常困难。小RNA深度测序技术突破了传统病毒检测方法的局限性，开辟了大规模、快速诊断植物病毒的领域。利用这种技术能同时检测植物样品中已知的和未知的、含量高的及含量低的所有的RNA病毒、DNA病毒以及类病毒。本文探讨了小RNA深度测序及其组装技术在检测木本植物病毒中的应用，以期全面地了解木本植物病毒的种类多样性。我们的研究为发掘新的植物病毒资源以及预防林业生产上的病毒病害提供了指导。
　　利用高通量测序技术对采自浙江杭州表现花叶症状的紫藤(Wisteria sinensis)、采自浙江临安表现花叶症状的南天竹(Nandina domestica)和浙江桐乡表现花叶卷叶症状的桑树(Morus alba L.)的病原进行了分子鉴定。利用小RNA深度测序技术，通过contigs拼接和比对，3种植物上的病毒分别为紫藤花叶病毒(Wisteria veinmosaic virus，WVMV)、黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus，CMV)和桑花叶卷叶病相关病毒(Mulberry mosaic leaf roll-associated virus，MMLRaV)，其中CMV侵染我国南天竹为国内的首次报道。
　　对采自浙江临安表现花叶症状的美国山核桃(Carya illinoinensis(Wangenh.)K.Koch)样品进行了基于小RNA深度测序技术的高通量鉴定，该病毒为1种新的RNA病毒，暂命名为美国山核桃花叶相关病毒(Pecan mosaic-associated virus，PMaV)。 PMaV基因组全长9310 nt，序列中A、T、C、 G4种碱基的含量分别为35.35％、25.49％、18.49％和20.66％，5'非编码区(5' UTR)包含57个核苷酸，3'非编码区(3'UTR)包含175个核苷酸。PMaV的基因组结构具有典型的马铃薯Y病毒属成员的基因组结构特征，包含一个9078nt的开放阅读框(Open ReadingFrame，ORF)，经推导其编码一个由3026个氨基酸(amino acid，aa)聚合而成的多聚蛋白，推测PMaV编码的多聚蛋白翻译后会被切割成11个成熟的蛋白质:P1、HC-Pro、 P3、6K1、 C1、6K2、 NIa-VPg、NIa-Pro、NIb、 CP、 PIPO。它的多聚蛋白切割位点分别是LYWRGF/S(P1/HC-Pro)、KLYKVG/G(HC-Pro/P3)、DVITLQ/S(P3/6K1)、CMTFQ/S(6KI/C1)、DAIRFQ/S(C1/6K2)、DTITLQ/G(6K2/NIa-VPg)、 DEIQFE/A(NIa-Vpg/NIa-Pro)、 DSMKFQ/G(NIa-Pro/NIb)和AGASAQ/S(NIb/CP)。用PMaV基因组全序列与36种其他马铃薯Y病毒科成员的全序列进行同源性比较和系统进化树分析。PMaV全序列与莴苣花叶病毒(Lettuce mosaic virus，LMV)的相似度最高，为58.9％，并与LMV的进化关系最为紧密，形成一个小进化簇。PMaV多聚蛋白氨基酸全长序列与PVY属其它病毒的同源性在52％-53％之间。PMaV的CP蛋白序列在核苷酸水平上与LMV的同源性最高，为73％;在CP氨基酸水平上的同源性与芜菁花叶病毒(Turnip mosaic virus，TuMV)最高，为68％。多聚蛋白氨基酸全长序列以及系统进化树均显示PMaV与LMV的进化关系最为紧密。由此可见，无论是按照Adams等人的标准:核苷酸一致性小于76％，且氨基酸一致性小于82％;还是按照ICTV第八次报告中确定的标准:核苷酸一致性小于85％，或CP氨基酸序列一致性小于80％，PMaV显然符合Potyvirus属不同种的定种标准。通过病毒汁液摩擦接种的方法，PMaV无法侵染本氏烟(Nicotiana benthamiana)和普通烟(N.tabacum)两种供试植物。感病美国山核桃的叶片经负染后，在透射电镜下看到许多线状的病毒粒子，呈柔软弯曲或较直的线状，长约750 nm，符合PVY属病毒粒子的特征。
　　对采自云南德宏州的柠檬（Citrus limon）病叶样品进行了基于深度测序技术的分子鉴定。结果表明，该柠檬受到了啤酒花矮化类病毒(Hop stunt viroid, HSVd)的侵染。HSVd全长序列与HSVd CC-D isolate1(GenBank登录号:FJ716188.1)的同源性为100％。在C.limon中，HSVd来源的小RNA（siRNAs）长度以21 nt为主，来源于HSVd正义链和负义链的siRNAs数量几乎相等。HSVd-siRNAs序列的5'起始核苷酸碱基偏好于鸟嘌呤(Guanine，G)。此外，热点区分析显示，大量的HSVd-siRNAs来源于HSVd基因组的C区和V区。植物类病毒的侵染和产生症状与类病毒来源的小RNA有关，位于HSVd多变区（V区）的5-6个核苷酸碱基构成的木质陷孔病表达序列“cachexia expression motif”决定了寄主症状的发生。利用生物信息学手段，我们从HSVd来源的小RNA中，提取到了67条5'端前10个碱基包含“cachexia expression motif”序列的HSVd-siRNA，然后通过预测软件psRNA Target对HSVd-siRNAs进行靶基因预测，对其中五个数值最高的靶基因与症状发生的关系进行了分析。同时，用miRNA靶基因预测软件RNA22验证了这五个靶基因是由HSVd-siRNAs所调控的。我们的研究结果表明，HSVd-siRNAs可能参与了寄主的基因表达，并影响寄主病害症状的产生。
　　通过高通量小RNA测序对采自浙江临安的表现花叶症状的大青样品进行了病毒鉴定，该病毒为中国大青金色花叶病毒(Clerodendrum golden mosaic chinavirus，ClGMCNV)。ClGMCNV的DNA-A组份全序列长2776 bp，与Clerodendrumgolden mosaic China virus complete DNA-A genome, isolate YX1(GenBank登录号:FN396962.1)相似性为99％; DNA-B组份全序列长2729 bp，与Clerodendrum goldenmosaic China virus complete DNA-B genome, isolate YX1(GenBank登录号:FN396963.1)同源性98％。采用了Velvet和Velvet-Oases两种方法，并设定了不同的参数(k-mer分别为15、17、19、21)，对大青样品的深度测序数据进行了分析。研究发现，在对序列进行拼接比对时，不同的拼接软件和不同的参数设置对实验的结果有很大的影响。利用Velvet软件，K-mer为15时，拼接得到的contigs数量及长度最大，可以覆盖ClGMCNV基因组全长70％以上，而K-mer为21时，拼接得到的contigs仅仅能覆盖ClGMCNV基因组全长30％左右。利用Velvet-Oases分析方法，我们将不同K-mer值组装的contigs又进行了拼接组装，发现最终得到的contigs覆盖到基因组的比例显著提高，最高达到88.25％。我们的研究提供了一套利用small RNA深度测序技术结合生物信息学分析鉴定病毒以及组装得到病毒基因组的流程。为了更加清楚地看到深度测序所得到的病毒来源小RNA在病毒基因组上的分布情况，我们用可视化工具SeqMonk对测序得到的小RNA序列进行了全基因组浏览，结果显示ClGMCNV不同组分的基因组全长上，明显存在没有病毒源小RNA覆盖的区域。

目录

声明

致谢

摘要

1 绪论

1．1 植物病毒检测技术研究进展

1．1．1 生物学测定法

1．1．2 电子显微镜法

1．1．3 血清学检测

1．1．4 分子生物学检测

1．1．5 第二代测序(Next-generation sequencing，NGS)检测法

1．2 我国木本植物病毒研究概况

2 实验方法

2．1 样品采集

2．2 植物病毒基因组克隆及基因组序列分析

2．2．1 试剂金法提取植物总DNA

2．2．2 植物总RNA的提取

2．2．3 植物病毒基因的反转录

2．2．4 超保真DNA聚合酶扩增反应

2．2．5 RACE-PCR(Rapid Amplification of cDNA Ends-PCR)

2．2．6 PCR产物纯化

2．2．7 大肠杆菌感受态细胞制备

2．2．8 连接

2．2．9 大肠杆菌感受态细胞转化

2．2．10 菌落PCR检测

2．2．11 序列测定与比对分析

2．3 小RNA深度测序

2．3．1 样品RNA的准备

2．3．2 小RNA文库构建及库捡

2．3．3 小RNA上机测序

2．4 生物信息学分析

2．4．1 小RNA测序原始数据处理与分析

2．4．2 病毒来源小RNA分析

2．4．3 病毒基因组二级结构预测

2．4．4 多聚蛋白切割位点分析

2．4．5 系统进化树构建

2．4．6 病毒重组分析

3 三种木本植物RNA病毒的分子鉴定

3．1 材料与方法

3．1．1 材料来拆

3．1．2 样品RNA提取及送测

3．1．3 小RNA文库构建及Illumia测序

3．1．4 小RNA深度测序数据分析

3．1．5 病毒汁液摩擦接种

3．2 结果与分析

3．2．1 紫藤花叶病毒的分子鉴定

3．2．2 南天竹花叶病毒的分子鉴定

3．2．3 桑树花叶卷叶病毒的分子鉴定

3．2．4 木本植物来源的WVMV、CMV及MMLRaV摩擦接种实验结果

3．3 讨论

4 美国山核桃花叶病毒的分子鉴定

4．1 材料与方法

4．1．1 材料来源

4．1．2 样品RNA提取及送测

4．1．3 小RNA文库构建及Illumia测序

4．1．4 小RNA深度测序数据分析

4．1．5 病毒序列分析

4．1．6 病毒摩擦接种

4．2 结果与分析

4．2．1 小RNA深度测序结果

4．2．2 小RNA的拼接及美国山核桃病毒的饰查

4．2．3 美国山核桃样品中病毒基因组克隆和序列分析

4．2．4 美国山核桃花叶相关病毒(PMaV)来源小RNA分析

4．2．5 美国山核桃花叶相关病毒摩擦接种结果

4．2．6 美国山核桃花叶相关病毒负染电镜观察结果

4．3 讨论

5 柠檬矮化类病毒的分子鉴定

5．1 材料与方法

5．1．1 材料来源

5．1．2 样品RNA提取及送测

5．1．3 小RNA文库构建及Illumia测序

5．1．4 小RNA深度测序数据分析

5．1．5 柠檬啤酒花矮化类病毒小RNA的靶基因预测

5．2 结果与分析

5．2．1 小RNA深度测序结果

5．2．2 小RNA的拼接及柠檬病毒的筛查

5．2．3 啤酒花矮化类病毒HSVd基因组克隆和序列分析

5．2．4 啤酒花矮化类病毒来源小RNA分析结果

5．2．5 柠檬啤酒花矮化类病毒小RNA的靶基因预测

5．3 讨论

6 中国大青金色花叶病毒的分子鉴定

6．1 材料与方法

6．1．1 材料来源

6．1．2 样品RNA提取及送测

6．1．3 小RNA文库构建及Illumia测序

6．1．4 小RNA深度测序数据分析

6．2 结果与分析

6．2．1 小RNA深度测序结果

6．2．2 小RNA的拼接及大青病毒的筛查

6．2．3 中国大青金色花叶病毒基因组克隆和序列分析

6．2．4 中国大青金色花叶病毒源小RNA分析结果

6．2．5 中国大青金色花叶病毒源小RNA Velvet-Oases分析结果

6．2．6 中国大青金色花叶病毒源小RNA在病毒基因组上的分布

6．3 讨论

参考文献

附录