稻瘟病菌MoSom1剪切异构体、PKA磷酸化位点及含LisH模体蛋白编码基因的功能分析

摘要

稻瘟病是世界水稻产区最重要的病害之一，而稻瘟病菌是研究植物与病原互作的模式病原真菌。了解稻瘟病菌的致病分子机理对杀菌剂的研发和病害的有效防控具有重要意义。本实验室先前的研究发现，稻瘟病菌转录调控因子MoSom1作用于cAMP-PKA信号途径下游，调控稻瘟病菌的形态分化和致病过程。本文对稻瘟病菌MoSom1剪切异构体、PKA磷酸化位点及含LisH模体蛋白编码基因的功能进行了较为系统的研究，取得以下结果：
　　1.稻瘟病菌MoSom1不同剪切异构体具有相同的生物学功能。
　　用MoSOM1的6种不同剪切方式序列回补△mosom1突变体的结果显示，不同剪切方式回补转化子的生长、产孢和致病性均能恢复到野生型水平，可见，MoSOM1的不同剪切方式不影响其正常的生物学功能。
　　2.稻瘟病菌MoSom1的S227氨基酸残基是一个关键的PKA磷酸化位点。
　　生物信息学分析显示，稻瘟病菌MoSom1中含8个预测的PKA磷酸化S/T残基，分别为T151、S188、S227、S228、S512、T603、T629和S642。对这些残基的缺失突变结果显示，只有MoSOM1△S227,228缺失突变体表型和致病性不能恢复到野生型。进一步对S227和S228的替换(A or E)突变结果显示，MoSOM1S227E、MoSOM1S228和MoSOM1S228的表型与野生菌株一致，而MoSOM1S227A的表型和致病性不能恢复。上述结果证实，稻瘟病菌MoSom1的S227残基是一个关键的PKA磷酸化位点。
　　3.稻瘟病菌中编码含LisH模体蛋白基因的功能分析。
　　稻瘟病菌MoSom1含一个保守的LisH模体。生物信息学分析发现，在稻瘟病菌基因组中总共有7个含LisH模体蛋白的编码基因，除已报道的MGG_04708(MoSOM1)和MGG_03198(TIG1)外，其余的MGG_01665、MGG_06742、MGG_00753、MGG_04137和MGG_09369还未见有研究报道，为探索这些基因的生物学功能，我们展开了对上述5个基因的敲除工作。目前已分别获得MGG_01665、MGG_00753和MGG_04137基因的敲除突变体，△MGG_01665和△MGG_04137突变体的表型（包括生长、形态分化和致病力）与野生型菌株相似，而△MGG_00753突变体对寄主的致病力有一定下降。经过二十多次对MGG_06742和MGG_09369基因敲除的原生质体转化实验，分别获得五百多个和两百多个转化子，但未能鉴定到这两个基因的敲除突变体，因此，初步判断它们可能是稻瘟病菌生存不可缺少的基因。
　　4.稻瘟病菌MoSom1互作蛋白的初步筛选。
　　利用亲和纯化的方法获得可能与MoSom1互作的混合蛋白样品，LC/MS分析结果显示候选互作蛋白有1101个，根据功能可将其归为23个不同类别，其中与信号转导途径相关的有37个。进一步分析显示，这37个候选蛋白中包含MAPK信号途径中的组件如Pmk1(MGG_09565)、Mkk2（MGG_06482）、Ras1(MGG_06154)等。后续有待用酵母双杂交(Y2H)实验进一步验证这些候选蛋白是否能在体外条件下与MoSom1互作，进而探究稻瘟病菌cAMP-PKA途径和MAPK途径下游的cross talk。

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摘要

第一章 文章综述

1 稻瘟病与稻瘟病菌

1．1 稻瘟病

1．2 稻瘟病菌的侵染循环

2 cAMP-PKA信号途径

2．1 酵母cAMP-PKA信号途径研究进展

2．2 稻瘟病菌cAMP-PKA信号途径研究进展

3 转录因子Flo8和LisH模体的研究进展

3．1 Flo8概况

3．2 LisH模体概况

4 本研究的目的与意义

第二章 材料与方法

1 实验材料

1．1 供试菌株

1．2 供试质粒载体

1．3 供试植物

1．4 供试试剂

1．5 供试抗生素

1．6 培养基及配方

2 实验方法

2．1 常规PCR反应

2．2 DNA操作

2．3 RNA操作

2．4 稻瘟病菌基因的敲除及互补

2．5 稻瘟病菌基因组的Southern Blot(地高辛标记法)

2．6 蛋白操作

第三章 结果与分析

1 MoSom1不同剪切异构体的功能分析

2 MoSom1的PKA磷酸化位点功能分析

2．1 MoSom1 PKA磷酸化位点的生物信患学初步预测

2．2 预测位点缺失载体的构建

2．3 点缺失转化子的获得及表型分析

2．4 T151、S227和S228丙氨酸和谷氨酸替换载体的构建

2．5 MoSOM1T151A／E、MoSoM1S227A／E和MoSOM1S228A／E替换转化子的获得及表型分析

3 稻瘟病菌含LisH模体蛋白编码基因的敲除

3．1 稻瘟病菌中含LisH模体蛋白编码基因的生物信息学分析

3．2 MGG_01665、MGG_04137和MGG_00753的敲除

3．3 MGG_06742和MGG_09369的敲除

4 MoSom1互作蛋白的初步筛选

第四章 全文总结与讨论

参考文献

附录