基于抗氧化作用的蜂胶促创伤修复机理研究

摘要

蜂胶是西方蜜蜂工蜂从胶源植物幼芽或树干损伤处采集的树脂，并混入其上颚腺、蜡腺等分泌物混合加工而成的一种具有芳香气味的胶黏性物质。蜂胶具有复杂的化学成分和广泛的生物学活性。近年来，随着蜂胶生物学活性研究的不断深入，其促进创伤修复这一重要的药理作用也逐渐引起人们的重视。近年来，不断有相关的体内试验研究报道蜂胶这一重要的生物学活性。然而由于相关的研究目前还不够充分，且缺乏相关的体外实验进一步证实和探索，蜂胶促创伤修复的具体机制一直不明晰。本研究通过建立以小鼠皮下成纤维细胞L929为研究对象的体外实验模型，初步探索了中国蜂胶和巴西蜂胶提取物对L929细胞增殖、迁移及胶原等基因表达的影响，并研究了二者对过氧化氢(H202)致L929损伤的保护作用及可能机制，以期为蜂胶促创伤修复的进一步研究提供参考。研究的主要内容和结果如下:
　　(1)采用高效液相色谱(HPLC)对比研究了中国蜂胶乙醇提取物(EECP)和巴西蜂胶乙醇提取物(EEBP)的主要成分及含量，并通过化学分析方法对比研究了这两种不同来源蜂胶乙醇提取物中总黄酮和总酚的含量。结果表明，EECP和EEBP在化学成分上差异较大，EECP中主要为黄酮类化合物，EEBP中主要为酚酸类化合物，在总黄酮和总酚含量上，EECP要显著高于EEBP。
　　(2)以小鼠皮下成纤维细胞L929为研究对象，研究EECP和EEBP对其增殖、迁移及胶原等基因表达的影响。结果表明，EECP和EEBP没有促进L929增殖和迁移的作用，并且超过一定浓度范围后会表现出相应的细胞毒性，此外，两者对Ⅰ和Ⅲ型胶原基因的mRNA表达上也没有明显的刺激作用，但对生长因子TGF-β1的mRNA表达有轻微的抑制作用，对基质金属蛋白酶MMP-2的mRNA表达有一定的促进作用。
　　(3)通过H2O2诱导的L929细胞损伤模型，对比研究EECP和EEBP对H202致细胞活力及变化的影响，并进一步研究EECP对H202作用下L929胶原表达变化的影响。结果表明，H2O2能呈剂量依赖性降低细胞存活率，而不同浓度的EECP和EEBP都能显著提高高浓度H2O2作用下细胞存活率，且EECP的保护效果明显优于EEBP。此外，EECP能抑制H2O2作用下Ⅰ和Ⅲ型胶原mRNA表达的降低，这对蜂胶调节创伤修复具有重要意义。
　　(4)采用化学方法对比研究EECP和EEBP的DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除能力及总还原力。结果表明两者均具有良好的抗氧化能力，且EECP在这3个抗氧化指标上都明显优于EEBP。
　　(5)采用qRT-PCR和western bolt技术研究了EECP对L929抗氧化相关基因表达的作用。结果表明，EECP能在一定程度上促进抗氧化相关基因在mRNA及蛋白水平上的表达，这对于蜂胶调节创面氧化应激水平有重要意义。
　　(6)以H2O2诱导的L929细胞损伤模型，进一步探索EECP降低H202作用下细胞夕匕亡率的分子机制。结果表明，EECP可能通过降低H202对Erk信号通路的激活，从而降低L929细胞的死亡率。
　　综上所述，蜂胶促进创伤修复的主要机制可能与其基础活性如抗氧化等有关，而并非是通过直接促进修复细胞的增殖和迁移等方式。这一结果为揭示蜂胶促创伤修复的分子机制提供了科学依据。然而创伤修复是一个极为复杂的过程，修复进程除了与创面氧化应激程度有关，还与伤口感染及炎症反应程度有关，蜂胶还可能通过抗炎及抗感染的方式减弱阻碍修复不利因素，从而促进修复。此外，蜂胶成分复杂，不同提取方式所提取的有效成分会有所差异，加上体内外环境的差异性，蜂胶促创伤修复的机理可能更为复杂。因此，还需要大量的体内外实验进一步探索，从而为蜂胶药理活性的研究和蜂胶产品的开发提供更多参考。

目录

声明

摘要

缩写语Abbreviations

第一章 文献综述

1 蜂胶对创(烧)伤组织的作用

1．1 蜂胶对再上皮化的作用

1．2 蜂胶对肉芽组织形成的作用

1．3 蜂胶促进伤口收缩的作用

1．4 蜂胶对细胞外基质生成的作用

2 蜂胶促创(烧)伤修复作用可能的机制

2．1 蜂胶抗炎作用对创(烧)伤修复的影响

2．2 抗氧化作用对创(烧)伤修复的影响

2．3 抗菌作用对创(烧)伤修复的影响

3 小结

第二章 研究目的意义与主要内容

1 研究的目的意义

2 研究思路

3 研究的主要内容

4 技术路线

第三章 两种植物来源蜂胶提取物成分分析

1 实验材料

1．1 材料和试剂

1．2 主要仪器和设备

2 实验方法

2．1 蜂胶乙醇提取物的制备

2．2 蜂胶化学成分分析及总黄酮总酚含量的测定

2．3 数据统计分析

3 结果与讨论

3．1 高效液相色谱法(HPLC)对EECP和EEBP成分分析结果

3．2 EECP和EEBP主要化学成分比较

4 小结

第四章 两种蜂胶提取物对L929细胞增殖、迁移及胶原等基因表达的影响

1 实验材料

1．1 材料和试剂

1．2 主要仪器与设备

2 实验方法

2．1 细胞培养

2．2 CCK8法检测蜂胶对L929细胞增殖和活力的影响

2．3 划痕实验观察蜂胶对L929细胞迁移的影响

2．4 蜂胶对L929胶原等基因mRNA表达的影响

2．5 数据统计分析

3 结果与讨论

3．1 EECP和EEBP对L929细胞增殖和活力的影响

3．2 EECP和EEBP对L929细胞迁移的影响

3．3 EECP和EEBP对L929胶原等基因mRNA表达的影响

4 小结

第五章 蜂胶乙醇提取物对H2O2致L929细胞损伤的保护作用及可能机理

1 实验材料

1．1 材料与试剂

1．2 主要仪器与设备

1．3 主要试剂和配方

2 实验方法

2．1 自由基及总还原力测定

2．2 不同浓度H2O2对L929细胞存活率的影响

2．3 蜂胶提取物(EECP和EEBP)存在条件下H2O2对L929细胞存活率的影响

2．4 蜂胶提取物(EECP)作用下H2O2对胶原基因表达的影响

2．5 胞内ROS含量的测定

2．6 蜂胶对L929抗氧化相关基因mRNA及蛋白表达的影响

2．7 实时荧光定量PCR反应

2．8 蛋白免疫印记(western blot)

2．9 结果统计分析

3 结果与讨论

3．1 EECP和EEBP自由基清除力及总还原力

3．2 不同浓度H2O2作用下L929细胞的存活率

3．3 EECP和EEBP对H2O2作用下的L929死亡率的影响

3．4 EECP对H2O2作用下L929胶原基因mRNA表达的影响

3．5 EECP对H2O2诱导的胞内ROS水平的影响

3．6 EECP对抗氧化基因表达的影响

3．7 EECP对H2O2作用下MAPK及PI3K／AKT信号通路变化的影响及意义

4 小结

第六章 总结与展望

1 总结

2 创新点

3 研究展望

参考文献

攻读硕士期间的科研成果

致谢